Primer preadipositler, adiposit metabolizmasını kontrol eden moleküler yolları anlamak için değerli bir deneysel sistemdir. Tavuk embriyoları, preadipositleri adiposit gelişiminin en erken aşamasından izole etme fırsatı sağlar. Bu yöntem, civcivlerde erken yaşam yağ büyümesi ve gelişme embriyosunun fonksiyonel analizi için kullanılabilecek olgun adiposite farklılaşma kapasitesi ve yüksek canlılığa sahip hücreler üretmek için optimize edilmiştir.
Adipojenik farklılaşma süreci, tavuklar ve insanlar arasında oldukça karşılaştırılabilir. Bu nedenle, izole preadipositler, insanlar ve kümes hayvanları ile ilgili çalışmalar için çift önerilen bir model olarak kullanılabilir. Embriyo gövdesini% 70 etanol ile temizlemeye başlamak için.
Daha sonra sindirimden sonraki adımlarda filtrasyon sırasında paraziti önlemek için, tüyleri çıkarmak için cilt yüzeyini steril gazlı bezle nazikçe ovalayın. Daha sonra femoral yağ depolarının çiftini ortaya çıkarmak için bacaklar ve karın bölgesi arasındaki cildi kesin. Cildi bacağın etrafında tutmak ve femoral deri altı yağını nazikçe çıkarmak için bir elinizle kavisli forseps kullanın.
diğer taraftan. Daha sonra, depoyu yavaşça bacaktan uzaklaştırmak için kavisli forseps kullanın. Dokuları beş mililitre toplama ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve yağ yastığının diğer tarafı için diseksiyonu tekrarlayın.
Şimdi, toplanan yağ yastıklarını sterilizasyon çözeltisi içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve kabı birkaç kez döndürerek kısa bir süre durulayın. Daha sonra yağ pedlerini PBS içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına aktararak sterilizasyon çözeltisini durulayın. Plakayı yavaşça döndürün ve bir kez daha PBS ile yıkayın.
Yağ dokularının sindirimi için, bunları önceden ısıtılmış enzimatik çözelti içeren 15 milimetrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra tüpe bir çift uzun düz makas batırın ve sonunda çözeltideki yağ dokularını mümkün olduğunca küçük parçalara ayırın. Kıyılmış dokuyu ve enzimatik çözeltiyi 25 mililitrelik otoklavlanmış bir şişeye aktarın.
Şişeyi parafin filmle sarın ve şişeyi sindirim için 37 santigrat derecede bir yörüngesel çalkalayıcı inkübatöre yerleştirin. Sindirimden sonra, iyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, pipetleme yoluyla 250 mikrometrelik bir doku süzgecinden 15 mililitrelik bir tüpe filtreleyerek sindirilmemiş doku ve döküntü parçalarını çıkarın.
Şimdi, şişeyi dört mililitre büyüme ortamı ile durulayarak şişeye yapışmış hücreleri çıkarın ve hücre süspansiyonunu aynı 15 mililitrelik tüpe filtreleyin. Daha sonra, filtrede sıkışmış hücreleri çıkarmak için büyüme ortamını tekrar pipetleyerek, süzgeci durulayın. Hücre fraksiyonunu peletlemek ve hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire etmek için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın.
Peleti bir mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponunda nazikçe yeniden askıya alın, pipetleyerek, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri içeren tüpe beş mililitre büyüme ortamı ekleyerek hücreleri seyreltin ve pipetleyerek, hafifçe karıştırın. Şimdi, hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine pipetleyin ve 50 mililitrelik yeni bir tüpe filtreleyin.
Daha sonra süzgeci ilave beş mililitre büyüme ortamı ile durulayın ve oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yaparak hücreleri toplayın. Süper natantı dikkatlice aspire edin. Kalan hücre peletini pipetleme ile bir mililitre büyüme ortamında yeniden askıya alın Hücre yoğunluğunu ve canlılığını belirlemek için, pipetleme yoluyla her numunenin 10 mikrolitresini tripan mavisi içinde karıştırın.
Karışımın 10 mikrolitresini hemositometreye yükleyin ve hücreleri sayın. 24, 48 ve 72 saat sonra preadipositlerin analizi normal hücre morfolojisi ve sayısı gösterdi. Preadipositlerin adipojenik indüksiyonu lipid damlacıklarının hızlı farklılaşmasını ve birikimini gösterdi.
İzolasyon sırasında preadipositlerin agresif kullanımı hücre hasarına ve düşük hücre sayısına neden olmuştur. Önleyici tedbirler alınmasına rağmen mikrobiyal kontaminasyon gözlenebilir. Yağ kırmızısı O ile lipit boyaması, preadipositlerin adipojenik indüksiyon altında hızla lipit damlacıkları geliştirmeye başladığını ve birikimin 24, 48 ve 72 saat içinde gözlemlendiği gibi zamanla ilerlediğini göstermiştir.
Hücre sayısına göre lipid birikimi lipid ve DNA boyaları kullanılarak ölçüldü. Hem lipid birikimi hem de hücre proliferasyonu zamanla artmıştır. Düşük hücre sayısı veya hasarlı hücreler, doku fraksiyonları çok uzun süre sindirildiğinde gözlenebilir.
Bu nedenle, bir buçuk saatlik sindirimin aşılmaması önerilir. İzole preadipositler gen ekspresyon çalışmaları için kullanılabilir. cDNA sentezinde ve takip qPCR veya RNAseq'te kullanılmak üzere yeterli RNA elde edilebilir.
