Bu, insan meme dokusunun uzun süre canlı ex vivo olarak tutulmasını sağlayan ilk protokoldür ve doğrudan insan meme dokusu ile insan meme kanseri arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, meme adipositleri, bağışıklık hücreleri, vasküler yapılar, düktal yapılar ve hücre dışı matris dahil olmak üzere insan meme dokusunun makroskopik parçalarının ex vivo'yu canlı tutmasını sağlar. Bu teknik, kişiselleştirilmiş tıp, farmasötik gelişim ve tümör başlangıç patofizyolojisi ve fibrozis ve hücre dışı matris tadilatı gibi daha yavaş meme kanseri süreçleri de dahil olmak üzere meme kanseri araştırmalarının çeşitli alanları için büyük etkilere sahiptir.
Bu prosedürü gösterenler Tulane yüksek lisans öğrencisi Katherine Hebert ve laboratuvarımdan Tulane tıp öğrencisi Rakesh Gurrala. Başlamak için, hazırlanan jelatin çözeltisini 37 santigrat derecelik bir su banyosunda eritin. Altı kuyu plakasının kuyuları için her pistona bu çözeltinin 2,5 mililitresini dağıtmak için beş veya 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.
Jelatin katılaştıktan sonra pNIPAAm kodlu ASC plakalarını biyo-güvenlik kabinine taşıyın. Pistonları yavaşça bu plakaların kuyularına yerleştirin, böylece jelatin ASC'lere temas eder. Jelatin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ASC tabakasıyla doğrudan temas halinde olacak şekilde tartmak için pistona metal bir yıkayıcı yerleştirin.
Pistonlarla birlikte plakayı yavaşça biyo-güvenlik kabindeki steril kutuya hareket ettirin ve kapağı üzerine yerleştirin. Kutuyu dört derecelik bir buzdolabına taşıyın veya plakayı 30 dakika boyunca biyo-güvenlik kabininde buz ve buz kovasına yerleştirin. Bir biyo-güvenlik kabininde, insan meme dokusunu 10 mililitre steril PBS ile üç kez yıkayın.
BC-MPS'yi kaba bir şekilde kıymak için steril forseps ve jilet kullanın ve mümkün olduğunca fazla fasya ve bağ dokusunu çıkarmaya çalışın. Bağ dokusu çıkarıldıktan sonra, homojen bir sıvı kıvamına gelene kadar dokuyu kıymak için steril bir jilet kullanın. Kıyılmış dokunun pipetlemesine yardımcı olmak için bir P1000 pipet ucunun ucunu kesin.
1,5 mililitrelik bir tüpte, metin el yazmasında açıklandığı gibi kıyma dokusunu, kanser hücre çizgilerini ve BC-MPS medyasını birleştirin. Alt hücre sayfası için kullanılacak ACS plakasını inkübatörden biyo-güvenlik kabinine taşıyın ve ortamı plakadan emişli olarak alın. Pipet hazırlanan meme dokusu karışımını kesik pipet ucunu kullanarak alt ACS plakasının kuyusunun ortasına koyun, pistonlu üst ACS plakasını içeren kutuyu biyo-güvenlik kabinine taşıyın.
Jelatin pistonlarını pNIPAAm kaplı plakadan hafifçe çıkarın ve doku karışımının üzerine yerleştirin. Kuyuya BC-MPS ortamı ekleyin ve BC-MPS karışımı ve pistonları ile alt ACS plakalarını steril plastik kutuya dikkatlice hareket ettirin. Kutunun kapağını, kültürün kirlenmesini önlemeye dikkat ederek taşıma için yerleştirin.
Alt plakayı kutuda ve 37 santigrat derece inkübatörü jelatin eriyene ve üst ACS tabakası alt katmana yapışmaya başlayana kadar kuluçkaya yatırın. Daha sonra plakaları olan kutuyu biyo-güvenlik kabinine taşıyın, kuyunun dibine tutturulmuş kanser hücreleri ile dokuyu gözlemlemek için pistonları alt plakalardan hafifçe çıkarın. Altı kuyu plakasının kapağını tekrar alt plakaya yerleştirin ve jelatinleri tamamen eritmek ve üst tabakanın alt katmana tutturulmasını sağlamak için 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Plakaları yavaşça bir biyo-güvenlik kabinine taşıyın ve medyayı 10 mililitrelik serolojik pipetle kuyunun kenarından emiş edin. Dokunun yerinden çıkılmasını önlemek için her kuyunun kenarına iki mililitre taze ortam ekleyin. BC-MPS'yi istenen süre boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte koruyun.
Medyayı iki ila üç günde bir değiştiriyoruz. BC-MPS analize hazır olduğunda plakayı biyo-güvenlik kabinine taşıyın. Herhangi bir dokunun yanlışlıkla yerinden çıkarılmasını önlemek için medyayı serolojik pipetle çıkarın.
Her kuyuya bir birim PBS ekleyin. Daha sonra PBS'yi serolojik bir pipetle çıkarın. Her kuyuya bir mililitre hücre ayrıştırma çözeltisi ekleyin ve bu hücrelerin kopmasını sağlamak için plakayı beş dakika boyunca inkübatöre geri taşıyın.
Kuluçkadan sonra, hücreleri ve dokuyu bir biyo-güvenlik kabininde kültür plakasından tamamen ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Çözeltiyi doku ile birlikte 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve iki mililitre PBS ekleyerek kalan hücreleri toplayın. Hücreler floresan ise tüpü alüminyum folyo ile sarın.
Hücreleri dokudan tamamen ayrıştırmak için tüpü 10 ila 20 dakika boyunca bir yörüngesel çalkalayıcıda sürekli ajitasyon altında 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bir biyo-güvenlik kabininde, tüpte kalan hücre kümelerini bozmak için serolojik bir pipet kullanın. Ve numuneyi 250 mikro metrelik doku süzgecinden yeni bir 15 mililitrelik tüpe filtreleyin.
Kalan hücreleri toplamak için süzgeci bir mililitre PBS ile durulayın. Üst katmanda yüzecek olan adipositleri kanser hücrelerinden ve bir peletle karıştırılan ASC'lerden ayırmak için numuneleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 500 kez santrifüjleyin. Adipozit tabakasını künt kesim pipet ucu kullanarak yeni bir tüpe aktarın.
Numuneyi tekrar santrifüjlayın ve kalan çözeltiyi adipositlerin altından çıkarmak için bir şırınga ve bir iğne kullanın. Kalan çözeltiyi, hücre peletini bozmadan ASC'leri ve kanser hücrelerini içeren tüpten epire edin. PELETI PBS veya BC-MPS ortamlarında yeniden askıya alın ve hücreleri floresanlara göre sıralamak için akış sitometrisi kullanın.
Birleştiği ASC sayfasının iç çekişme destekli deseni burada gösterilmiştir. Şamandıralı insan meme dokusu, 14 günlük kültürden sonra ASC hücre çarşafları tarafından kuyunun dibine sabitlenmişti. Floresan mikroskopi görüntüleri, 14 gün sonra RFP hücre hatlarını ifade eden MDA-MB-231 ile BC-MPS'nin kararlılığını ve en az altı gün boyunca üç negatif tümör eksplant PDX ile göstermektedir.
Meme dokusu içeren BC-MPS, 100X ve 20X büyütmede dokunun doğal unsurlarını göstermek için 14 gün boyunca in vitro, lekeli ve görüntü olarak kültürlendi. Makrofaj belirteçlerinin boyanarak kültürde üç ve yedi gün sonra birincil makrofajların korunması gösterildi. Bodipy lekeli MDA-MB-231 hücrelerinin 14 gün sonra akış sitometrisi analizi, 2D kültüründe minimal lipit birikimini ve geniş lipit birikimini ve BC-MPS'yi göstermektedir.
Lipid pozitif MDA-MB-231 hücrelerinin oranı BC-MPS'de 2D kültüründen 26.2 kat daha fazlaydı. BC-MPS'de kültürlenen hücreler, standart 2B kültüründe kültürlenen hücrelere kıyasla lipid damlacıklarını arttırır. MDA-MB-231 hücreleri ile BC-MPS etiketli RFP'nin hızlandırılmış görüntüleri, sözde pod ve yüksek hareketlilik ile 231 hücrenin amip hareketini gösterdi.
Meme dokusu yeterince küçük kıyılmalı ve kuyunun dibine dağıtılacak kadar ayrılmalıdır. Meme dokusu çok şamandıradır ve parçalar çok büyükse veya birbirine çok yakın kümelenmişse, ASC hücre sayfaları meme dokusunu kuyunun dibine tutturamaz. Ortaya çıkan meme dokusu kanseri yapıları, belirli hücre türlerini izole etmek için enzimyasal sindirime tabi tutulabilir.
Bu, meme dokusundaki kanser hücrelerinin kemoterapiye geleneksel 2D kültürüne veya organoidlere kıyasla nasıl farklı tepki vereceği gibi önemli soruların cevaplanmasına izin verecektir.
