Name: invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish
Uploaded: 2017-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

TGF-β aile üyeleri üzerinde çalışmalar Kanser Genomik Merkezi Hollanda tarafından desteklenmektedir. Sijia Liu ve Jiang Ren Leiden Üniversitesi&#39;nde çalışmanın 4 yıldır Çin Burs Konseyi tarafından desteklenmektedir. Biz MCF10A hücre hatları için Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Kanser Enstitüsü, Detroit, MI, ABD) teşekkür ederim.

Transgenik floresan zebrabalıkları Tg (fli: EGFP) kullanan tüm araştırmalar EGFP&#39;yi etti gerginlik, (EGFP) Uluslar arası kurallara göre gerçekleştirilmiştir, konut ve deneyler de dahil olmak üzere, damar sistemini 20 -etiketli ve yerel Kurumsal Komitesi tarafından onaylandı Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi Hayvan Refahı (Dier Ethische Commissie (DEC) için. NOT: Embriyo toplanması (Şekil 1A), mikroenjeksiyon (Şekil 1B), tarama (Şekil 1C) ve analizi (Şekil 1D): Şekil 1 &#39;de özetlendiği üzere, protokol kabaca dört adımda ayrılmıştır. 1. Enjeksiyon iğneler hazırlamak <ol><li> borosilikat cam mikrokapilerler ile enjeksiyon iğneleri hazırlayın. aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirmesi cihazı içine mikrokapiller koyun: hava basıncı, 500; Isı, 650; , 100 çekme; hız, 200; zaman,bunlar, enjeksiyon için kullanılana kadar 40. Bir iğne tutucu plaka enjeksiyon iğneleri tutun. </li></ol> 2. Enjeksiyon için Floresan, Genetiği Etiketli Meme Kanseri Hücreleri hazırlayın <ol><li> L-glutamin,% 10 fetal sığır serumu ve 1 içeren DMEM yüksek glikoz ortamında, 37 ° C&#39;de kültür insan göğüs kanseri MDA-MB-231 hücreleri: 100 penisilin-streptomisin (LTR yükseltici) durumunda. </li><li> Kültür,% 5 at serumu, 20 ng / ml EGF, 10 mg / ml L-glutamin içeren DMEM / F12 ortamında 37 ° C &#39;de, meme epitelyal hücre hatları, MCF10A (M-1) ve MCF10A-Ras (M2), insülin, 100 ng / ml, kolera enterotoksin, 0.5 mg / mL, hidrokortizon, ve 1: 100 pen-strep. </li><li> Ko-transfekte HEK293T hücrelerine PLV-mCherry, pCMV-VSVG 21, pMDLg-RRE (gag / pol) 22 ve pRSV-REV 22 plazmid ile MCherry lentivirüs üretir. Hasat hücre süpernatanları -80 ° C&#39;de transfeksiyon ve mağaza 48 saat sonra. </li><li> ben5 ng / ml polibren varlığında normal kültür ortamı ile 1: nfect lentiviral süpernatanları ile 24 saat boyunca% 30 izdiham, MDA-MB-231, M1, M2 hücreleri 1 seyreltilmiştir. </li><li> kararlı MCherry-ifade eden hücre çizgileri elde edilene kadar, izole edilmiş hücre klonlarının aşırı büyümesini sağlayan bir 96 oyuklu bir plaka, hücrelerin seyreltilmesiyle tek hücre klonları seçin. </li><li> Enjeksiyon için hücre kültürü, bir T75 şişesi. % 0.5 tripsin-EDTA, tedaviden% 80 konflüense hücreleri hasat. 1x PBS 2-3 kez hücreleri yıkayın. </li><li> PBS yaklaşık 200 mcL hücrelerin yeniden askıya. enjeksiyondan önce en az 5 saat boyunca bunları 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 3. Enjeksiyonluk balığı Embriyolar hazırlayın <ol><li> Zebra balığı üreyen ayarlayın ve Rosen ve ark önceki jove makalesinde de gösterildiği gibi, embriyolar toplamak. 23. </li><li> döllenmemiş ve anormal embriyolar kaldırarak 0-4 hpf olan embriyolar seçin. Petri dis embriyolar tutunYumurta, su (60 ug / ml, deniz tuzlan; ~ 60 embriyo / çanak) tam saat ve 28 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 48 hpf ince cımbız ile embriyolar Dechorionate. </li><li> 40 ug / ml tricaine (3-aminobenzoik asit) aşağı yukarı 2 dakika enjeksiyondan önce, ancak enjeksiyon için en fazla 2 den saat önce yumurta su ihtiva eden aktarılması embriyolar anestezisi. Not: Tricaine stok çözeltisi (4 mg / ml, 100x), 7.4, pH değeri ile, iki kez damıtılmış suyun 97.9 mL 1 M Tris-baz (pH 9) 2.1 mL tricaine tozu 400 mg gibi hazırlanır. -20 ° C dondurucuda muhafaza edilmelidir. </li></ol> Perivitelline Uzaya 4. enjekte İnsan Göğüs Kanseri Hücreleri <ol><li> bir enjeksiyon iğnesinin hücre süspansiyonu yükleme 15 uL. mikromanipülatör üzerine iğne monte edin ve 5-10 um bir uç açma çapı elde etmek için ince cımbız ile iğne ucu kopar. </li><li> mikroenjeksiyon gerçekleştirmek için bir pnömatik picopump ve manipülatör kullanın. Adjust picopump 400 hücrelerini her zaman enjekte etmek. Enjeksiyondan önce,% 1 agaroz içeren bir Petri kutusu üst hücreleri enjekte ederek el ile hücre sayısını sayar. </li><li> 10 embriyo her sefer hat kadar anestezi embriyolar, düz,% 1 agaroz enjekte plaka üzerinde (2-3 gün sonra döllenme (dpf)). </li><li> Iğne (yani, çapraz) sokulması için tercih edilen bir pozisyonda embriyolar yerleştirmek için enjeksiyonlar sırasında elle enjeksiyon levhasını. </li><li> Enjeksiyon bölgesinde iğne ucu Noktaya ve yavaşça yolk kesesi ve zebra balığı embriyo (Şekil 2A) periderm arasındaki perivitelline boşluk içine iğne ucu yerleştirin. </li><li> yaklaşık 400 MCherry-etiketli tümör hücreleri enjekte edilir. yolk kesesi sarısı kesesinin içine implantasyonu önlemek için patlamış olmadığından emin olun. </li></ol> 5. Doc içine İnsan Göğüs Kanseri Hücreleri enjekte <ol><li> i tarif edildiği gibi bir iğne ve zebra balığı embriyolar hazırlanması<html> n, protokol, 1, 2, ve 3. adımı. </li><li> Doküman embriyonun sırt tarafında yaklaşılabilir böylece 45 ° iğne açı kullanın. </li><li> Doktor (Şekil 3A) başlangıç noktası haline iğne, sadece kanal yolk kesesi üzerinden genişletilmesi başladığı dorsal ve yaklaşık 400 hücre enjekte yerleştirin; kanal içinde birim darbe yolk kesesi hemen sonra genleştiğinde enjeksiyon doğrudur. Not: bazı ardışık enjeksiyonlar iğne ayıklanması olmadan gerçekleştirilebilir. </li><li> Yumurta suya enjekte Zebra balığı embriyolar aktarın. Not: olarak önemli farklılıklar tek zebra balığı embriyolar arasında bulunur ve enjeksiyon oluşabilir sonra embriyo ölümü gibi, (100) etrafında zebra balığı embriyolarının nispeten büyük, kanser hücreleri enjekte edilmelidir. </li><li> balık ve memeli hücreleri için en uygun sıcaklık gereksinimlerini karşılamak için 33 ° C&#39;de zebra balığı embriyolar koruyun. </li></ol>_title &quot;&gt; 6. Enjekte Embriyolar Ekran <ol><li> Perivitelline alanı enjeksiyon için 2 saat sonra enjeksiyon (HPI) (Şekil 2), flöresanlı bir stereomikroskop altında her bir balık ekran veya Doküman enjeksiyon (Şekil 2) için 2-24 hpi embriyoların hepsi enjekte edilir sağlamak için tümör hücrelerinin benzer sayısı. Bu tür yırtılmalar (Şekil 2B) ya da yumurta sarısının tekrar enjeksiyonları (Şekil 3B) enjeksiyon hataları, embriyo çıkarın ve enjekte aşağıdaki hücreleri (Şekil 2C ve 3B) veya (Şekil 2B ve 3B) eşik ile embriyolar ortaya çıkarmak. kültürde yaklaşık 400 hücrelerle sadece embriyolar tutun. </li><li> Hücreler zaten dolaşımda hücrelerle embriyo kaldırarak enjeksiyon işlemi sırasında tedavüle doğrudan tanıtıldı ihtimalini ekarte etti. Ayrıca, Doc kütleli bir bir hücre (Şekil 2D ile herhangi bir embriyo kaldırmak </strong&gt;). </li></ol> 7. Görüntü ve Metastatik Süreci Analiz <ol><li> Geniş ucu Pasteur pipeti ile bir kaç anestezi embriyolar toplamak ve bir polistiren çanak cam alt aktarın. </li><li> fazla suyu çıkarmak ve yumurta suyun sınırlı bir miktarda tutun. Bir saç döngü aracı ile pozisyona embriyo işleyin ve camın üstüne bir kapak yerleştirin. </li><li> Su daldırma ya da uzun mesafeli kuru amaçları ile kombinasyon halinde bir ters konfokal mikroskop kullanarak. ilgi bölgesi mümkün olduğunca objektif olabildiğince yakın olacak şekilde embriyo yerleştirin. </li><li> nedeniyle sıvı buharlaşma ölüm riskini azaltmak için anestezi hemen sonra görüntüleme gerçekleştirin. <ol><li> embriyo üzerinde aynı konumda EGFP-etiketli damar ve MCherry etiketli tümör hücrelerinden yakalama sinyalleri birlikte kaydedilmesi, iki görüntüleme birleştirme kanalını kan damarlarının hücreleri enjekte. </li><li> Her Zebra balığı embriyo için, görüntülerin iki farklı setleri toplamakKafa bölgesi ile kuyruk bölgesinden. </li></ol></li><li> yaygın hücre sayısını ölçmek. <ol><li> Perivitelline alan enjeksiyonlar için, ön ve arka bölgeleri 4, 15 ile embriyonik balık gövdesine doğru hücre kütlesinden yaygın olan her bir balık hücrelerin sayısını; bölgeler yüzme kesesi dorsal üstüne, cepheden kalp boşluğuna sınırları dışındadır ve ürogenital açılış ötesinde kaudale. </li><li> Doküman enjeksiyon için, tek tek dolaşım (MDA-MB-231), ile ilgili tailfin kollajen liflerini işgal hücreler veya kaudal hematopoetik doku (CHT) içinde hücrelerin birlikte (M2) tarafından oluşturulan küme sayısının sayısını her 19 zebra balığı. </li></ol></li><li> konfokal mikroskopi kullanılarak daha ayrıntılı olarak invazyonu ve metastazı Çalışma (tavsiye). <ol><li> Görüntünün tamamı düşük büyütme (4X objektif) kullanınVücut tümör hücre yayılması modelinin bir genel bakış için ve. Not: Daha yüksek büyütme (20X ve 40X kazanım) intra ve peri-tümör anjiogenezini ve embriyo gövde dissemine hücrelerinin tam yerleşimini incelemek için uygundur. </li><li> kırmızı flüoresans ile işaretli implante tümör hücrelerinin taramak için zebra balığı embriyo damar sistemini ve bir 543 nm lazer tarama 488 nm lazer kullanır. Sekiz ila on adımda her embriyoyu tarayarak yüksek kalitede görüntü elde etmek. Tarama ve her adım altı kez ortalama. </li></ol></li><li> daha da deneyler için gerekli olup olmadığını dikkatlice yumurta suya geri embriyo yerleştirin. </li></ol> 8. Post Hoc Analizi Ardından Varyans (ANOVA) tek yönlü Analizi İstatistiki Analiz Gerçekleştirmek

<ol>
	<li>Wan, L., Pantel, K., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+moving+new+biological+insights+into+the+clinic.">Tumor metastasis: moving new biological insights into the clinic.</a> Nat. Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Obenauf, A. C., Massagu&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+at+a+distance:+Organ-specific+metastasis.">Surviving at a distance: Organ-specific metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li><li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse.">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol. Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li><li>Teng, Y., Xie, X., Walker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+human+cancer+cell+metastasis+in+zebrafish.">Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish.</a> BMC cancer. 13 (1), 453 (2013).</li><li>Konantz, M., Balci, T. B., Hartwig, U. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+xenografts+as+a+tool+for+in+vivo+studies+on+human+cancer.">Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer.</a> Ann N Y Acad Sci. 1266 (1), 124-137 (2012).</li><li>Zhao, S., Huang, J., Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+zebrafish+from+the+perspective+of+cancer+research.">A fresh look at zebrafish from the perspective of cancer research.</a> J Exp Clin Cancer Res. 34 (1), 80 (2015).</li><li>Stanton, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diethylnitrosamine-induced+hepatic+degeneration+and+neoplasia+in+the+aquarium+fish,+Brachydanio+rerio.">Diethylnitrosamine-induced hepatic degeneration and neoplasia in the aquarium fish, Brachydanio rerio.</a> J. Natl. Cancer Inst. 34 (1), 117-130 (1965).</li><li>Lam, S. H., Wu, Y. L., Vega, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+gene+expression+signatures+between+zebrafish+and+human+liver+tumors+and+tumor+progression.">Conservation of gene expression signatures between zebrafish and human liver tumors and tumor progression.</a> Nat. Biotechnol. 24 (1), 73-75 (2006).</li><li>Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+state+of+the+art+of+the+zebrafish+model+for+toxicology+and+toxicologic+pathology+research-advantages+and+current+limitations.">The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research-advantages and current limitations.</a> Toxicol. Pathol. 31, 62-87 (2003).</li><li>Stoletov, K., Klemke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+of+the+day:+zebrafish+as+a+human+cancer+model.">Catch of the day: zebrafish as a human cancer model.</a> Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).</li><li>Lee, L. M., Seftor, E. A., Bonde, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+human+malignant+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+embryos:+assessment+of+migration+and+cell+division+in+the+absence+of+tumor+formation.">The fate of human malignant melanoma cells transplanted into zebrafish embryos: assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation.</a> Dev. Dynam. 233 (4), 1560-1570 (2005).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat. Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).</li><li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+the+dynamic+tumor+cell-vascular+interface+in+transparent+zebrafish.">High-resolution imaging of the dynamic tumor cell-vascular interface in transparent zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (44), 17406-17411 (2007).</li><li>Rouhi, P., Jensen, L. D., Cao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Drabsch, Y., He, S., Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-&#946;+signalling+controls+human+breast+cancer+metastasis+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Transforming growth factor-&#946; signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model.</a> Breast Cancer Res. 15 (6), R106 (2013).</li><li>He, S., Lamers, G. E., Beenakker, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Nicoli, S., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish/tumor+xenograft+angiogenesis+assay.">The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay.</a> Nat. Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).</li><li>de Boeck, M., Cui, C., Mulder, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smad6+determines+BMP-regulated+invasive+behaviour+of+breast+cancer+cells+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Smad6 determines BMP-regulated invasive behaviour of breast cancer cells in a zebrafish xenograft model.</a> Sci. Rep. 6, 24968 (2016).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Stewart, S. A., Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-delivered+stable+gene+silencing+by+RNAi+in+primary+cells.">Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells.</a> RNA. 9 (4), 493-501 (2003).</li><li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat. Rev. Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Perivitelline alanı ve Doküman enjeksiyonları ile zebra balığı embriyolar: Burada, Tg (EGFP fli1), meme kanseri hücrelerinin invaziv davranışı incelemek için iki yöntem tarif. transgenik zebra balığı embriyolara kimyasal boya ya da floresan protein ile etiketlenmiş kanser hücreleri enjekte ederek, invazyon ve metastaz dinamik ve uzamsal özellikleri açık bir şekilde bir floresan mikroskobu altında tek hücre veya kümelenme seviyesinde gerçek zamanlı olarak izlenir. Bir çok duru...

Klinikte Aşikar kanser metastazı &quot;metastatik kaskad&quot; olarak bilinen karmaşık ve çok adımlı olaylar serisini içerir. Kaskad yoğun gözden geçirilmiş ve ardışık adımlarla içine disseke edilebilir: lokal invazyon, intravazasyonuna, yayılması, tutuklama, damar genişletme ve sömürgeleştirme 1, 2. Kanser metastazı patogenezinde ve in vivo potansiyel tedavi stratejilerinin geliştirilmesi daha iyi anlaşılması kanser hücresi yayılmasının sağlam konak modellerini gerektirir. Kemirgen modelleri iyi bilinmekte ve yaygın olarak metastaz 3 değerlendirmek için kullanılır, fakat bu yaklaşım, düşük verimlilik ve etik sınırlamaları vardır ve belirli bir manipülasyon metastatik fenotipi etkileyebilecek olup olmadığını belirlemek için, bir ön planda model olarak yüksek maliyetlidir. Diğer etkili, güvenilir ve düşük maliyetli bir model hızlı bir şekilde (epi) genetik değişiklikler veya Pharmacolog potansiyel etkilerini erişmek için gerekenik bileşimleri. Onların yüksek genetik insanlara homoloji ve onların embriyolar zebrabalıkları (Danio rerio) şeffaflığı önemli bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmıştır ve gittikçe gelişimsel süreçleri mikrop-konak etkileşimleri, insan hastalıkları, ilaç tarama, vb çalışmalarına uygulanıyor . 4. Zebrabalıkları kurulan kanser metastazı modelleri kemirgen modellerinde 5, 6 eksiklikleri bir cevap verebilir. Spontan neoplazi güçlükle vahşi zebrabalıkları 7&#39;de görüldüğü halde, zebrafish istenen kanserini tetiklediği birçok sürüncemeli teknikler vardır. Karsinojen indüklenen gen mutasyonu veya sinyal yolunun aktivasyonu histolojik ve moleküler modeli karsinogenez, zebra balığı 7, 8, 9, insan hastalığı taklit edebilir. tak byonkogen veya tümör bastırma genetik manipülasyonlar ileri çeşitli olanaklar ing ve ters (transjenik) zebra balığı, kanser gelişimi ve kuvvetli 6, 10 potansiyel çalışmaları sağlamıştır. Zebrabalıkları indüklenen kanser modelleri sindirim, üreme, kan, sinir sistemi ve 6 epitel dahil geniş bir yelpazede kapsar. Kanser araştırmalarında zebrabalıkları kullanımı nedeniyle bu organizmada insan tümör hücre ksenogreft modellerinde kurulmasına son zamanlarda genişledi. Bu, ilk başarılı 2005 11 Blastula aşamasında zebra balığı embriyolarının engrafted edildi insan metastatik melanom hücreleri ile bildirilmiştir. Birkaç bağımsız laboratuarlar çeşitli siteler ve gelişim aşamalarında zebrafish içine memeli kanser hücresi hatlarının çok çeşitli tanıtarak bu öncü çalışmanın fizibilite valide var 5 &lt;/ Sup&gt;. Örneğin, blastodisc ve Blastula aşamasının blastosist yakınındaki enjeksiyonu; 5-günlük embriyolar yolk kesesi, perivitelline alan, Cuvier&#39;in (DOC) kanalı, ve 6-h arka ana damar içine enjeksiyonlar; 30 günlük bir bağışıklık larvalarının periton boşluğuna enjeksiyonu, 12 5 gerçekleştirilmiştir. Buna ek olarak, allojenik tümör nakilleri de zebrabalıkları 12, 13 bildirilmiştir. ksenogreftlerı kullanmanın büyük avantajlarından biri nakledilmiş kanser hücreleri kolayca floresan etiketli ve normal hücrelerden ayırt edilebilir olmasıdır. Bu nedenle, microtumor oluşumu 14, hücre istilası ve metastaz 15, 16, 17, tümör-indüklü anjiyogenezin 15, 1 dinamik davranışları ile ilgili araştırmalar8 ve kanser hücreleri ve ev sahibi arasındaki etkileşimler transgenik zebrabalıkları hatları 5 ürünler özellikle kullanım sırasında, 17 açık bir şekilde canlı balık vücutta görselleştirilebilir faktörleri. Doktor enjeksiyonlar 16 vasıtasıyla zebra balığı embriyolar: metastaz değerlendirmek için zebra balığı ksenogreft modellerinde yüksek potansiyel esinlenerek, Tg (EGFP çekildiğinde) arasında tailfin alanında farklı meme kanseri hücre çizgilerinin transvasküler ekstravazasyon özellikleri göstermiştir. Dönüştürücü büyüme faktörü-P (TGF-β) 16 ve kemik morfojenik protein transforme rolü (BMP), pro- / anti göğüs kanseri hücre istilası ve metastazda 19 sinyal yolları da bu modelde incelenmiştir. Ayrıca, biz de perivitelline uzay enjeksiyonları ile ksenograft zebrabalıkları modeller kullanılarak tedavüle çeşitli meme kanseri hücre çizgilerinin intravazasyon yeteneğini değinmeyecek. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Bu makale perivitelline boşluk veya Doc içine insan meme kanseri hücrelerinin enjekte dayalı Zebra balığı ksenograft modelleri için ayrıntılı protokoller sunar. yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme kullanarak, kan damarlarına intravasation ve avasküler tailfin alanına kan damarlarından hareket farklı insan göğüs kanseri hücrelerinin, invaziv davranışını temsil eder işlem gösterir.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>MP Biomedicals</td><td>AGAF0500</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Harvard Apparatus</td><td>300038</td><td></td></tr><tr><td>Cholera enterotoxin&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>227035</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>SP5 STED</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose media containing L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 media containing L-glutamine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21041025</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereo microscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>SigmaAldrich</td><td>227035</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>SigmaAldrich</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A (M1) cell line</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MCF10Aras (M2) cell line</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, USA)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wide-tip Pasteur pipette (0.5-20 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>F276456I</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VSVG plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PLV-mCherry plasmid</td><td>Addgene</td><td>36084</td><td></td></tr><tr><td>pMDLg-RRE (gag/pol) plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Houben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Pneumatic picoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>SigmaAldrich</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Prism 4 software</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRSV-REV plasmid</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Prof. Dr. Rob Hoeben (Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Tg (&lt;em&gt;fli:EGFP&lt;/em&gt;) zebrafish strain</td><td></td><td></td><td>Kindly provided by Dr. Ewa Snaar-Jagalska (Institute of Biology, Leiden University, Leiden, The Netherlands)</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>SigmaAldrich</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (3-aminobenzoic acid)</td><td>SigmaAldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes, polystyrene (60 &amp;times; 15 mm)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene dish with glass bottom</td><td>WillCo</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish

Birçok durumda, kanser hastaları değil, çünkü metastaz, birincil tümörün ölme. Çok sayıda kemirgen modelleri, in vivo kanser metastazı araştırmak için kullanılabilir olsa da, diğer etkili, güvenilir ve düşük maliyetli bir model hızlı bir şekilde (epi) genetik değişiklikler veya farmakolojik bileşiklerin potansiyel etkilerini erişmek için ihtiyaç vardır. Bunun gibi, biz göstermek ve bu hedefi destekleyecek zebra balığı embriyolarının enjekte insan meme kanseri hücreleri kullanılarak ksenogreft modellerinde fizibilitesini açıklar. Mikroskop altında, floresan proteinleri veya kimyasal olarak etiketli insan meme kanseri hücreleri transgenik zebra balığı embriyolarının transplante edilir, Tg (fli: EGFP), 48 saat sonra, döllenme perivitelline boşluk veya Cuvier (DOC) kanalında. Kısa bir süre sonra, canlı balık vücudunda kanser hücresi invazyonu, yayılması ve metastaz zamansal-mekansal işlem bir floresan mikroskop altında görüntülenmiştir. Yani farklı enjeksiyon yerlerini kullanarak modelleri, başınaivitelline boşluk veya Doküman erken evre (içeri geçiş aşaması) ve geç evre olayları çok aşamalı metastatik kaskad (ekstravazasyon aşaması) yansıtan birbirine tamamlayıcıdır. Ayrıca, tümör çevresi ve tümör anjiyogenez perivitelline bir mekan içine enjekte ile gözlenebilir. Bütün deneysel dönem artık 8 günden daha olduğunu. Bu iki model, genetik ve farmakolojik manipülasyonlara yanıt olarak kanser metastazı hızla değerlendirilmesini sağlayan hücre etiketleme, mikro nakli ve fluoresans görüntü teknikleri birleştirir.

Bir perivitelline alanı enjeksiyonu ile embriyonik ksenograft zebra balığı modelinde, balık vücutta etiketli kanser hücrelerinin kan yoluyla yayılması etkin göç olarak kabul edilir. Bu işlem, tespit edilir ve yukarıdaki yöntemlerde tarif edildiği gibi, bir floresan mikroskobu altında ölçülebilir. Bu ksenograft modeli göstermek için, potansiyel (olmadan ya da C) bilinen invazyon / metastaz, HRAS transforme premalign in vitro ve iyi huylu, normal meme epitel h...

Watch this Scientific Journal Video about Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish at JoVE.com

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Burada, invaziv davranış araştırmak ve sırasıyla insan meme kanseri hücrelerinin içeri geçiş ve ekstravazasyondur potansiyelini değerlendirmek için, iki farklı enjeksiyon yerlerini, yani perivitelline alan ve Cuvier ait kanal kullanılarak ksenogreft Zebra balığı modellerini açıklar.

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

invasive-behavior-of-human-breast-cancer-cells-in-embryonic-zebrafish

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.5K Görüntüleme.  Leiden University Medical Center.  Burada, invaziv davranış araştırmak ve sırasıyla insan meme kanseri hücrelerinin içeri geçiş ve ekstravazasyondur potansiyelini değerlendirmek için, iki farklı enjeksiyon yerlerini, yani perivitelline alan ve Cuvier ait kanal kullanılarak ksenogreft Zebra balığı modellerini açıklar. 

Video: Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

This method utilizes zebrafish embryos to efficiently test the vascular invasive ability of cancer cells. Fluorescent cancer cells are injected into the precardiac sinus or yolk sac of developing embryos. Cancer cell vascular invasion and extravasation is assessed via fluorescence microscopy of the tail region 24 to 96 hr later.

Zebra balığı Kanser Hücrelerinin Vasküler İnvaziv Yetenek (Test<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

Kanser Araştırmaları

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

Zebrabalığı Tümör Ksenogreftlerinde Konak Anjiyojenik Yanıtın Vivo Görüntüleme ve Kantitasyonunda

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Gelişim Biyolojisi

Verimli In Vivo Tümör Çalışmaları için Larva Zebra Balığının Kullanılması

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Yazar Spotlight: Zebra Balıklarında Tümör Ksenotransplantasyonu Kullanarak Kanser Terapötiklerini İlerletmek

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Zebra balığı Kanser Hücrelerinin Vasküler İnvaziv Yetenek (Test

Zebra balığı Pediatrik Beyin Tümörlerinin Tümör Hücre Davranışının ve İlaç Yanıtının Uzun Vadeli İncelenmesi için Bağışıklık Yetenekli Ev Sahibi Olarak Transplantasyonu

Zebrabalığı Tümör Ksenogreftlerinde Konak Anjiyojenik Yanıtın Vivo Görüntüleme ve Kantitasyonunda

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem

Şeffaf Zebra Balığı Embriyolarında Tümör Ksenotransplantasyon Analizi için Basit, Hızlı ve Etkili Bir Yöntem