Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. disfonksiyonları iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır. Baker mayası mitokondrileri sekiz proteini kodlayan dairesel genom içerir.
Bu videoda, translojiyel ürünlerin radyoaktif etiketlemesi ve daha sonra jel elektroforez ile ayrılması yoluyla maya mitokondrisinde protein biyosentezini test etmek için kullanılan protokolü anlattık. Yordam birkaç önemli adım içerir. Donmuş stok kültürlerinden gelen mayayı uygun ortama sahip taze tabaklarda çizin.
Plakaları 24 ila 48 saat boyunca 30 derecede kültür inkübatörüne koyun. Bu kültürleri 15 mililitrelik bir tüpteki taze çizgiden iki mililitre orta derecede aşılayın ve 30 derecede 200 RPM'de ajite ederek bir gecede kuluçkaya yatırın. 600 nanometre dalga boyunda kültürün optik yoğunluğunu ölçün.
Steril tüplerdeki 0,2 emiciliği birimine karşılık gelen hacmi alın Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de maya hücrelerini palet edin. Bu süpernatant atın. Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın.
Maya hücrelerini oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de paletle. Üstnatant atın. Hücreleri iki mililitre taze silme agar ortamında seyreltin.
Optik yoğunluk 1,5 ila 1,9 arasında 1,5 ila 1,9 değerlerine ulaşana kadar 200 RPM ve 30 derecede alınan inkübte kenarı. Mikro santrifüj tüpündeki bir optik üniteye eşdeğer kültür hacmini aktarın. Tüpleri bir dakikalığına 3000 G'de döndürün.
Üstnatant atın. Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de maya hücrelerini paletle süpernatant atın.
Maya hücrelerini 0,5 mililitre steril çeviri tamponunda yeniden askıya alın. Süspansiyonu 15 mililitrelik tüpe yerleştirin. Sitosolik çeviriyi engellemek için 200 RPM ve 30 derecede alınan beş dakikalık kenar için mililitre başına 0,2 miligramlık son konsantrasyona kadar hücre süspansiyonuna sikloeximide ekleyin.
25'ten 30'a ekleyin S35 metiyonin S35 metiyonininin 25 ila 30 mikrokülerini hücre süspansiyonuna ekleyin ve 200 RPM ve 30 derecede alınan 30 dakika kenar boyunca kuluçkaya yatırın. 200 RPM ve 30 derecede alınan 10 dakikalık kenar için Incubate etiketlemesini durdurmak için etiketsiz soğuk metiyonin ve borymycin ekleyin. Maya hücrelerini 30 saniye boyunca 9.000 G'de santrifüjleme ile toplayın.
Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın. Maya hücrelerini oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de paletle. Üstnatant atın.
Palete ve girdaplara beş ila 10 saniye boyunca 75 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. pH 6.8 ile 0.5 molar tris tamponunun 500 mikrolitresini ekleyin. pH 6.8 ile.
Kısaca Girdap. Numuneye 600 mikrolitre metanol ekleyin. Beş saniyeliğine girdap.
Numuneye 150 mikrolitre kloroform ekleyin. Beş saniyeliğine girdap. Numuneleri 12.000 G'de iki dakika santrifüjleyin.Opaface'i bir örnekleyici ile dikkatlice atın.
Numuneye 600 mikrolitre metanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek dikkatlice karıştırın. Santrifüj örnekleri 12.000 G.Discard supernatant'ta iki dakika boyunca.
Paleti 80 derecede iki dakika kurutun. Çökemiş proteinleri 60 mikrolitre Laemmli numune tamponunda çözün. Numuneleri 14 derecede 10 dakika ısıtın.
Neden 17.5% Laemmli SDS poliakrilamid jel. Ceplere her numuneden 15 mikrolitre yükleyin. Mavi boya jel lenfin yaklaşık% 65'ine ulaşana kadar jeli soğuk odada çalıştırın.
Jel Kumasi parlak mavi ile leke ve yükleme kontrolü olarak gerekli tarama veya fotoğraf yapmak. Jeli jel kurutucuda kurutun. Üç ila beş gün boyunca depolama fosfor ekranı ile kasette saklayın.
Fosfor görüntüleyicilikte ekranı tarayın. Yukarıda açıklanan protokolün ardından, iki Saccharomyces cerevisiae suşundan mitokondriyal çeviri ürünleri atadık. Vahşi tip ve mutant varyantı silinmesi Aim23 gen kodlaması mitokondriyal çeviri başlatma faktörü üç.
Mitokondriyal çeviri ürünleri zaten aktif olarak etiketlenmiş ve denatüre poliakrilamid jelde ayrılmıştır. Örnekler, zaman seyrini oluşturmak için doygunluğa iki buçuk dakikada bir toplandı. Jel, beş günlük sergiden sonra lekelendi, kurutuldu ve tarandı.
Başarılı bir deneme durumunda, resim standart desene göre atanan sekiz bandı gösterir. Bununla birlikte, bireysel bantların yoğunlukları zorlanmaya ve deneysel koşullara bağlı olarak oldukça değişken olabilir. Her bant bir çeviri ürününe karşılık gelir.
Veriler, mutant suşunun mitokondriyal protein sentezi yapabileceğini göstermektedir, çünkü vahşi tipte görünen tüm ürünler bu mutantta görülebilir. Bununla birlikte, bantların yoğunlukları vahşi tipten farklıdır, yani Aim23'ün bu silinmesi mitokondriyal gen ekspresyonını etkiler. Kumasi mavi leke ile demlenir ve yükleme kontrolü görevi görür.
Verilerdeki sonuç, Image G veya Image Quan yazılımı kullanılarak suşlar veya deneysel koşullar arasındaki farkları belirlemek için ölçülebilir. Bunlar için her ürüne karşılık gelen sinyalin toplam sinyale oranı hesaplanır. Ortalama değerler ve standart sapmalar en az üç bağımsız deneyde hesaplanır.
Sentezlenen proteinin kinetiği geçen yılki deneyde incelenmiştir. Numuneler, etiketleme reaksiyonun soğuk methionin ve borymycin tarafından durdurulmasından sonra belirtilen zaman noktalarında toplanır. Bu kontrol, ürünün kararlılığını tahmin etmek için gereklidir.
Anti-Porin ile immün boyama bir antikor yükleme kontrolüdür. Maya mitokondrisinde protein biyosentezini incelemek için sıklıkla kullanılan yöntemi tanımladık. Bu protokol nispeten basit ve gerçekleştirilmesi hızlıdır.
Aynı zamanda, son derece avantajlı olan dört mayalı mitokondriyal mRNA'nın çeviri oranı hakkında değerli bilgiler elde etmeyi sağlar. Bununla birlikte, ek deneyler gerektiren çeşitli sınırlamalara sahiptir ve bu eyaletler arası protein ve mRNA seviyelerinde yatmaktadır. Mitokondriyal çeviri sisteminde bu fonksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilir, ancak mekanizmayı keşfetmek için daha gelişmiş teknikler kullanılmalıdır.
