Bu tekniğin en büyük avantajı, RNA bozulmasından etkilenmemiş yeni sentezlenmiş mRNA'yı ölçerek RNA polimeraz II aktivitesini yansıtmasIdır. Bu protokol başlangıçta mikrodizi hibridizasyonu kullanılarak tanımlanmıştır, ancak yeni transkripsiyonlu mRNA'nın sıralaması boyunca kolayca benimsenebilir. Bu prosedürü gösteren Tiago Baptista, bizim laboratuvar dan eski bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır.
S.cerevisiae hücrelerini aşıladıktan sonra, 150 RPM'de sürekli ajitasyon la bir gecede 30 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, 600 nanometre optik yoğunluğunu ölçmek. YPD orta 100 mililitre yaklaşık 0.1 bir OD600 için kültür seyreltmek.
OD600 0.8 civarında olana kadar hücreleri büyütün. Bundan sonra, S.pombe gece kültürünün OD600 ölçmek. Yas orta 500 mililitre yaklaşık 0.1 bir OD600 bu kültürü seyreltmek ve OD600 yaklaşık 0,8 olana kadar büyümesine izin.
İlk olarak, iki azı dört-thiouracil taze bir çözüm hazırlamak. Hazırlanan çözeltiyi oda sıcaklığında tutun ve ışıktan koruyun. S.cerevisiae ve S.pombe kültürleri için son konsantrasyon beş milimolar olduğunu dört-thiouracil çözüm ekleyin.
S.cerevisiae ve S.pombe kültürlerini sırasıyla 30 santigrat derece ve 32 santigrat derecede altı dakika boyunca sürekli ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her kültürün küçük bir aliquot kaldırın ve bir otomatik hücre sayacı veya Neubauer odası kullanarak hücreleri saymak. Hücreleri toplamak için 2, 500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj.
Supernatant atın ve bir kez PBS buz gibi hücreleri yıkayın. Santrifüj tekrar 2, 500 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için. Sonra, bir kez PBS buz soğuk beş mililitre hücreleri yeniden askıya.
S.cerevisiae ve S.pombe hücrelerini üçe bir oranında karıştırın. Karışık örnekleri 2, 500 kez g ve dört santigrat derecebeş dakika santrifüj edin. Sonra PBS çıkarın ve flaş sıvı azot hücreleri dondurmak.
Numuneyi kullanıma hazır olana kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, yaklaşık 20 ila 30 dakika buz üzerindeki hücreleri eritin. Metin protokolünde belirtildiği gibi RNA ayıklamak için uyarlanmış bir maya RNA ekstraksiyon kiti kullanın.
Bundan sonra, filtre kartuşu son toplama tüpüne aktarın. 100 santigrat dereceye önceden ısıtılmış DEPC ile işlenmiş RNase içermeyen su 50 mikrolitre ile RNA elute. Santrifüj 16, 000 kez g bir dakika için.
Daha sonra RNA'yı tekrar aynı tüpe çıkarmak için 50 mikrolitre önceden ısıtılmış DEPC ile işlenmiş RNase içermeyen su kullanın. Bir dakika boyunca 16,000 kez g'de santrifüj edin ve tüm numune hacminin filtreden geçtiğinden emin olun. Değilse, daha uzun bir süre için tekrar santrifüj.
Bittiğinde, uygun ekipmanı kullanarak numunenin saflığını ölçün ve kontrol edin. Daha önce edinilmiş Olan RNA konsantrasyonunu mililitrede iki miligrama ayarlamak için DEPC ile tedavi edilmiş nükleaz içermeyen su kullanın. Aliquot 200 mikrogram toplam RNA ve 10 dakika boyunca 60 santigrat derecede ısıtın.
Hemen iki dakika buz üzerinde soğutun. DEPC ile işlenmiş RNase içermeyen 600 mikrolitre su ekleyin. Biyosonyalasyon tampon 100 mikrolitre ekleyin ve sonra biotin HPDP 200 mikrolitre ekleyin.
Biotin HPDP çözeltisi çözeltiden dışarı çökerse, metin protokolünde belirtildiği gibi DMSO veya DMF'nin hacmini reaksiyon hacminin %40'ına kadar artırın. Numuneyi ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında hafif bir ajitasyonla üç saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, tüplere kloroform yaklaşık eşit hacim ekleyin ve şiddetle karıştırın.
Santrifüj 13, 000 kez g ve dört santigrat derece beş dakika. Daha sonra, dikkatle yeni iki mililitre tüpler içine üst faz aktarın. Numune hacminin yaklaşık 1/10'una eşit beş azı kaşığı sodyum klorür ekleyin.
Sonra örneği karıştırın. İlk olarak, biyotinylated RNA'yı 65 derecede 10 dakika ısıtın. Sonra beş dakika buz üzerinde örnekleri soğutun.
Biyotinylated RNA streptavidin kaplı manyetik boncuk 100 mikrolitre ekleyin. 90 dakika hafif sallayarak oda sıcaklığında kuluçka. Manyetik standa kiti ile sağlanan sütunlar yerleştirin.
Daha sonra, sütunlara oda sıcaklığında 900 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. 200 mikrolitre boncuk ve RNA karışımını kolonlara uygulayın. 1,5 mililitrelik tüplerde akış-through toplamak ve daha sonra aynı manyetik kolon atekrar uygulayın.
Etiketlenmemiş RNA fraksiyonunu temsil ettiği için gerekirse bu akışı devam edin. Farklı kesirlerin RT-qPCR doğrulanmasını başlatmak için, ilk olarak metinde özetlenen cDNA sentezini. Daha sonra standart bir protokol kullanarak gerçek zamanlı qPCR ile cDNA'yı yükseltin.
Dört-thiouracil ile ve dört-thiouracil olmadan kültürlenen yabani tip hücrelerden saflaştırılan kesirler transkript ölçülen düzeyleri bu prosedür özellikle etiketli RNA arındırır doğruladı. Spt20 delta suşuanalizi, toplam sabit durumlu RNA miktarının büyük ölçüde değişmediğini veya test edilen genler için sadece hafif bir şekilde azaldığını ortaya koymaktadır. Benzer sonuçlar bre1 için silinen suşlar için de görülür.
Ancak, spt20 delta suş yeni transkripsiyonu RNA analizi tüm test edilen genler için mRNA sentezinde üç ila beş kat azalma ortaya koymaktadır. Bu arada, bre1 kaybı daha ihtiyatlı ama yine de görünür bir düşüşe yol açar. Spt7'nin indüklenmez tükenmesi üzerine, destan kompleksinin yapısal bir alt birimi olan yeni transkripsiyon mRNA düzeyleri silme gerilimine benzer bir ölçüde azalır.
Toplam RNA düzeyleri genom çapında analiz ile ölçüldüğünde, sadece birkaç genin spt20'nin silinmesi üzerine yukarı veya aşağı düzenleyici olarak ifade düzeylerinin değiştiği görülmektedir. Ancak, yeni transkripsiyonu RNA analizi 4 üzerinde düzeyleri önemli ölçüde spt20 silinmesi üzerine en az iki kat azalır ortaya koymaktadır tomurcuklanan mayalarda RNA polimeraz II transkripsiyon üzerinde destan küresel bir olumlu etkisi göstermektedir. Bu yöntem Saccharomyces cerevisiae transkripsiyon içgörü sağlayabilir rağmen, sadece bu protokolü kullanarak hafif varyasyonlar ile uygulandı, biz mRNA bozulması küresel bir azalma ile telafi edildi mRNA sentezinde küresel bir azalma tespit edebilirsiniz.
