Bu protokol, mitokondriyal protein fonksiyonu elucidation sırasında temel bir adım olarak kabul edilen maya mitokondriyal proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için tasarlanmıştır. Protokol, farklı büyüme koşullarında tutulan maya suşlarımız için uygundur. Mitokondriyi incelemek olarak araştırma için güçlü bir aracı temsil ediyor.
Başlangıç olarak, 80 C'de depolanan gliserol stoğundan, tek kolonileri ilgi gerginliğinden izole etmek için bir YPD agar plakasına hücreleri çizgiler. Ve plakayı 2 ila 3 gün boyunca 30 C'de kuluçkaya yatırın. 10 ila 30 ml YPGal ortamı içeren 100 ml Erlenmeyer şişesinde YPD agar plakasından 2 ila 3 ayrı koloni aşılayarak bir başlangıç kültürü hazırlayın.
Matarayı 30 C'de 24 saat boyunca 180 ila 200 rpm'de kuvvetli sallanarak kuluçkaya yatırın. Başlangıç kültürünü 1 L taze YPGal ortamına seyrelterek 600 nm'de 0,1'den daha az optik yoğunluğa dönüştürün. Optik yoğunluk 1 ila 1,5'e ulaşana kadar hücreleri 30 C'de yaklaşık 12 saat boyunca 180 ila 200 rpm'de kuvvetli sallama ile yetiştirin.
Metinde açıklandığı gibi yüksek oranda saflaştırılmış mitokondrilerin yalıtımını gerçekleştirin. Ve üreticinin talimatlarını izleyerek Bradford testini kullanarak yüksek oranda saflaştırılmış mitokondriyal preparatın protein konsantrasyonunun belirlenmesi. Buz gibi SEM tamponu ile protein konsantrasyonu 10 mg/ml olarak ayarlayın.
40 l yüksek saflaştırılmış mitokondriyi dört 1,5 ml önceden soğutulmuş ve etiketli mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Birinci ve ikinci tüplere 360 l SEM tampon ekleyin. Ve üçüncü ve dördüncü tüplerde 360 l EM tamponu.
Pipet şemasını kullanarak, metne göre, ikinci ve dördüncü tüpe 4 L taze hazırlanmış proteinaz K ekleyin. Tüm tüpleri nazikçe karıştırdıktan sonra, ara sıra karıştırarak 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Proteinaz K aktivitesini durdurmak için dört tüpe de 4 L 200 mM PMSF ekleyin.
Tüpleri 20.000 x g'da 4 C'de 30 dakika santrifüjleyin ve peleti bozmadan süpernatantı 1,5 ml önceden soğutulmuş yeni bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Daha sonra, peletin 400 l buz gibi SEM tamponunda yeniden depolansın. Proteinaz K'nin olası izlerini inaktive etmek için, toplanan süpernatantı çökeltin ve peleti trikloroasetik asitle 10 dakika boyunca buz üzerindeki tüpleri 10 dakika boyunca son bir konsantrasyona yeniden biriktirin.
Trikloroasetik asitle işlenmiş örnekleri 12.000 x g'da 4 C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı çıkardıktan sonra peletiği 200 l numune tamponuna yeniden sunun. Bromofenol mavisi sararırsa, maviye dönene kadar 1 M Tris tabanının 1 ila 5 l'ini ekleyin. Tüm tüplere 4 l 200 mM PMSF ekleyin.
SDS-PAGE ve western blot tarafından daha fazla analiz edilene kadar örnekleri 80 C'de saklayın. 200 l yüksek saflaştırılmış mitokondriyi 1,5 ml önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Mitokondrileri buz gibi SEM tamponu ile bir kat seyreltin.
Küçük hacimlerle uyumlu bir sonicator kullanarak, buz üzerinde 30 saniye boyunca 3 kez sonicate mitokondri. Numuneyi 4 C'de 100.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı 1,5 ml önceden soğutulmuş yeni bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Çözünür protein fraksiyonu için tüpü S" olarak etiket ettikten sonra, tüpü buzda tutun.
400 l buz gibi SEM tamponunda bir önceki adımdaki peletin yeniden depolansın. Yeniden 100 l'lik peleti yeni bir 1,5 ml önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Submitochondrial parçacık fraksiyonu için tüpü SMP olarak etiketleyin ve tüpü buzda tutun.
Kalan 300 l resüspended peletini taze hazırlanmış 200 mM sodyum karbonatla bir kat seyreltin. Ve seyreltilmiş numuneyi 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatır. Daha sonra, numuneyi 4 C'de 100.000 x g'da 30 dakika santrifüjleyin.Süpernatantı yeni bir 1,5 ml önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
Karbonat süpernatant fraksiyonu için numuneyi CS olarak etiketleyin ve tüpü buzda tutun. 400 l buz gibi SEM tamponunda bir önceki adımdaki peletin yeniden depolansın. Ve karbonat çökelmiş fraksiyon için numuneyi CP olarak adlandırın.
Tüm örnekleri trikloroasetik asitle% 10'luk son konsantrasyona çökeltin ve tüpleri 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya bırakın. Daha sonra, numuneleri 12.000 x g'da 4 C'de 10 dakika santrifüjleyin.Süpernatantı çıkardıktan sonra, her peleteri numune tamponunda yeniden çıkarın. Örnek arabellek sarı olursa, maviye dönene kadar 1 M Tris tabanının 1 ila 5 l'ini ekleyin.
Tüm tüplere 1 l 200 mM PMSF ekleyin ve SDS-PAGE ve batı blot tarafından daha fazla analiz edilene kadar 80 C'de saklayın. Ham mitokondriyal fraksiyon sakkaroz yoğunluğu gradyan santrifüjasyonunda saflaştırılmış ve diğer hücresel kirleticilerde azalma gözlenmiştir. Mitokondriden mitoplast dönüşümüne, peletteki intermembran uzay proteini sitokrom b2'nin kaybolmasıyla izlendi.
Üstteki eşlik eden görünümle. Intermembran proteinI Sco1'in proteinaz K aracılı bozulması, ozmotik şok nedeniyle dış zar bozulmasına bağlı olarak gözlendi. Dış mitokondriyal membran bütünlüğü, sitokrom b2 ve Sco1'in pelet fraksiyonunda proteinaz K bozulmasına karşı korunması ile doğrulandı.
Benzer şekilde, matris çözünür protein KGD'nin korunması iç mitokondriyal membran bütünlüğünü doğruladı. Prx1 batı blot profili, intermembran uzayında ve matrisinde çift mitokondriyal lokalizasyon önerdi. Mitokondri, membran proteinlerinin topolojisini araştırmak için sonikasyon ve karbonat ekstraksiyona tabi tutuldu.
İntegral membran proteini dökülmesi pelet fraksiyonlarında kaldı. KGD'nin süpernatan fraksiyonunda tespit edildi. Peletteki KGD proteininin tespiti, SMP'lerin oluşumunu etkileyen sonication parametre varyasyonlarından kaynaklandı.
Sodyum karbonat tedavisinden sonra KGD ve SMP fraksiyonu çözünerek süpernatan fraksiyonda bulundu. Prx1 batı leke profili membran çevresi ile bir ilişki önerdi. Boyunokondriyal fraksiyonasyon protokolünün başarısı için, örneklere PMSF eklenerek hipotonik şişmeden sonra proteinaz K aktivitesinin durdurulması önemlidir.
Siteler, submitochondrial protein lokalizasyonu hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, mitokondriyal alt bileşenlerin proteomik çalışmaları sırasında temel olan mitokondriyal preparatların bütünlüğünü kontrol etmek için de kullanılabilir.
