Protokol, hayvan modellerine gerek kalmadan patofizyolojisini araştırmak için intervertebral disk dejenerasyonunun in vivo koşullarını simüle etmeyi amaçlamaktadır. İn vitro hücre kültürü ile karşılaştırıldığında, biyoreaktör organ kültürü tekniği, kontrol edilebilir ve tekrarlanabilir bir kültür durumunun sağlanmasına ek olarak, hücreleri kendi yerel biyolojik ve biyomekanik mikroçevrelerinde tutar. Yüzeydeki kir ve kılları temizlemek için tüm sığır kuyruğunu musluk suyuyla iyice durulayarak başlayın, ardından yüzeyi dezenfekte etmek için kuyruğu 10 dakika boyunca% 1 betadin çözeltisine daldırin.
İntervertebral disklerin veya IVD'lerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için kaudal omurgadan yumuşak dokuyu çıkarmak için 20 numaralı bir neşter kullanın. Omurların dikenli ve enine işlemlerini kemik çıkarma plier ile çıkarın. Tek tek hareket segmentleri elde etmek için her omur gövdesinin ortasından kemik pense ile enine kesin, ardından toplanan hareket segmentlerini Ringer'ın çözeltisine ıslanmış bir gazlı bezle bir Petri kabına koyun.
Hareket segmentlerini hafifçe hareket ettirerek omurlardaki IVD'yi bulun, ardından kemikli uç plakasının dışbükey tarafına dokunarak ve bularak büyüme plakasının yerini belirleyin. Testerenin bıçağını Ringer'ın çözeltisiyle soğutun ve IVD'lerin büyüme plakasında her iki tarafta birer tane olmak üzere iki paralel kesim yapmak için kullanın. IVD'leri Ringer'ın çözeltisi ile ıslatılmış temiz gazlı bezli temiz bir Petri kabına aktarın.
Neşter bıçağını kullanarak omur gövdesini ve büyüme plakasını kazıyın ve uç plakayı sağlam bırakın. Yükleme prosedürü için iki yüzeyi düz ve paralel konumlandırın ve kazınmış IVD'leri Ringer'ın çözeltisi ile ıslatılmış gazlı bezle taze bir Petri kabına aktarın. Disk yüksekliğini ve çapını bir kaliperle ölçün, ardından omur kemiğindeki kan pıhtılarını bir jet lavaj sistemi kullanarak Ringer çözeltisi ile temizleyin.
PBS'deki IVD'leri ve %10 penisilin streptomisinini 15 dakika boyunca sallanarak dezenfekte edin. Yüksek konsantrasyonlu antibiyotikleri PBS ve%1 penisilin streptomisi ile durulayın. Diskleri beş mililitre IVD kültür ortamı içeren IVD odalarına aktarın ve %85 nem ve %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatör ile biyoreaktör sistemine yerleştirin.
Diskleri, deney gruplarına göre farklı yükleme koşullarını koruyarak bir biyoreaktör sistemi içinde dört gün boyunca kültüre edin. Fizyolojik kontrol grubunda, günde iki saat boyunca 0.02 ila 0.2 megapaskal ve 0.2 hertz yükleme protokolü kullanarak yüksek glikoz ortamına sahip IVD'leri kültüre edin. Patolojik grupta, günde iki saat boyunca 0,32 ila 0,5 megapaskal ve beş hertz yükleme protokolü kullanarak düşük glikoz ortamına sahip IVD'leri kültüre edin.
Yükleme prosedürleri arasında, IVD'leri serbest şişme iyileşmesi için yedi mililitre IVD kültür ortamına sahip altı kuyulu plakalara yerleştirin. Disk yüksekliğini serbest şişme döneminden sonra ve deneysel süre boyunca dinamik yüklemeden sonra bir kaliper ile günlük olarak ölçün. İlk gün ilk dinamik yükleme döngüsünden sonra, IVD'leri doğrudan bir Petri kabına dikey bir konuma yerleştirin ve bir cımbızla stabilize edin.
Rekombinant TNF-alfa'ya patolojik grubun IVD'lerine dakikada yaklaşık 70 mikrolitre hızında yavaşça 30 kalibrelik bir insülin iğnesi enjekte edin. Enjekte ettikten sonra, şırınnayı yarıya kadar geri çekin ve enjekte edilen çözeltinin sızmasını önleyen bir vakum oluşturmak için pistonu çekin, ardından şırınnayı IVD'den tamamen çıkarın. Dejeneratif yükleme, sınırlı beslenme kaynağı ve TNF-alfa enjeksiyonu ile birlikte, dört günlük kültürden sonra NP dokusunda pro-enflamatuar belirteçler interlökin altı ve interlökin sekiz gen ekspresyonunda önemli bir artışa neden oldu.
Şartlandırılmış ortama interleukin sekiz protein salınımı, ikinci ve dördüncü gün patolojik grupta belirgin bir artış gösterdi. Yükleme sonrası disk yüksekliğinin azalması patolojik grupta fizyolojik gruba göre daha yüksekti ve farklılıklar ikinci ve üçüncü günlerden sonra ilk güne göre daha belirgindi ve bu da dejeneratif ve enflamatuar durumların ilerleyici bir etkisini gösteriyordu. Tekrarlanabilir IVD tüm organ kültürü modelleri için standartlaştırılmış diseksiyon tekniği önemlidir.
Çeşitli in vivo biyomekanik durumları simüle etmek için IVD'lere fizyolojik ve dejeneratif yüklemeler uygulamak için bir biyoreaktör gereklidir. Bu teknik, klinik önemi yüksek olan insan IVD eksplantları üzerinde uygulanabilir. Erken evre disk dejenerasyonunda etkili tedaviler geliştirmek için yeni bir preklinik modeldir.
