Протокол направлен на моделирование in vivo условий дегенерации межпозвоночных дисков для исследования его патофизиологии без необходимости использования животных моделей. По сравнению с культурой клеток in vitro, метод культуры органов биореактора поддерживает клетки в их родном биологическом и биомеханической микросреде в дополнение к поставке контролируемого и воспроизводимого состояния культуры. Начните с тщательного промывания всего хвоста крупного рогатого готья водопроводной водой для удаления грязи и волос на поверхности, затем погрузите хвост в 1%-ный раствор бетадина на 10 минут для дезинфекции поверхности.
Используйте скальпель No 20 для удаления мягких тканей из каудального отдела позвоночника, чтобы облегчить идентификацию межпозвоночных дисков, или IVD. Удалить остистые и поперечные отростки позвонков плоскогубцами. Разрезайте поперечно плоскогубцами через середину каждого тела позвонка для получения отдельных сегментов движения, затем поместите собранные сегменты движения в чашку Петри с марлей, смочещенной в растворе Рингера.
Найдите IVD в позвонках, мягко перемещая сегменты движения, затем определите местоположение пластины роста, коснувшись и найдя выпуклую сторону костной концевой пластины. Охладите лезвие ленточной пилы раствором Рингера и используйте его, чтобы сделать два параллельных разреза в ростовой пластине IVD, по одному с каждой стороны. Переложите IVD в чистую чашку Петри с чистой марлей, смочещенной раствором Рингера.
Соскоблите тело позвонка и пластину роста с помощью лезвия скальпеля, оставив торцевую пластину нетронутой. Расположите две поверхности ровно и параллельно для процедуры загрузки и переложите соскобленные IVD в свежую чашку Петри с марлей, смочещенной раствором Рингера. Измерьте высоту и диаметр диска с помощью суппорта, затем очистите сгустки крови в кости позвонков раствором Рингера с помощью струйной системы промывки.
Дезинфицировать IVD в PBS и 10% пенициллин стрептомицин с встряхиванием в течение 15 минут. Смойте антибиотики высокой концентрации PBS и 1% пенициллина стрептомицина. Перенесите диски в IVD-камеры, содержащие пять миллилитров питательной среды IVD, и поместите их в систему биореактора с инкубатором при температуре 37 градусов Цельсия с влажностью 85% и 5% углекислого газа.
Культивируйте диски в течение четырех дней в системе биореактора, поддерживая различные условия нагрузки в соответствии с экспериментальными группами. В физиологической контрольной группе культивируйте IVD со средой с высоким содержанием глюкозы, используя протокол загрузки от 0,02 до 0,2 мегапаскаля и 0,2 герца в течение двух часов в день. В патологической группе культивируйте IVD с низкой глюкозной средой с использованием протокола нагрузки от 0,32 до 0,5 мегапаскалей и пяти герц в течение двух часов в день.
Между процедурами загрузки поместите IVD в шестистволочные пластины с семью миллилитрами питательной среды IVD для свободного восстановления отека. Ежедневно измеряйте высоту диска с помощью суппорта после периода свободного набухания и после динамической нагрузки в течение экспериментальной продолжительности. После первого динамического цикла загрузки в первый день непосредственно поместите IVD в чашку Петри в вертикальном положении и стабилизируем их пинцем.
Вводят рекомбинантный TNF-альфа с помощью инсулиновой иглы 30-го калибра медленно со скоростью примерно 70 микролитров в минуту в IVD патологической группы. После инъекции потяните шприц наполовину назад и потяните плунжер, чтобы создать вакуум, который предотвращает утечку впрыскиваемого раствора, а затем полностью извлеките шприц из IVD. Дегенеративная нагрузка в сочетании с ограниченным питанием и инъекцией TNF-альфа вызвала значительное увеличение экспрессии генов провоспалительных маркеров интерлейкина шести и интерлейкина восьми в ткани NP после четырех дней культивированием.
Высвобождение белка интерлейкина восемь в кондиционированную среду показало заметное увеличение патологической группы на второй и четвертый день. Снижение высоты диска после нагрузки было выше в патологической группе по сравнению с физиологической группой, а различия были более выражены через второй и третий дни по сравнению с первой, что свидетельствует о прогрессирующем эффекте дегенеративных и воспалительных состояний. Стандартизированный метод рассечения важен для воспроизводимых моделей культуры всего органа IVD.
Биореактор необходим для применения физиологических и дегенеративных нагрузок на IVD для моделирования различных биомеханических состояний in vivo. Этот метод может быть применен к эксплантам IVD человека, что имеет высокую клиническую значимость. Это новая доклиническая модель для разработки эффективных методов лечения на ранней стадии дегенерации диска.
