O protocolo visa simular condições in vivo de degeneração do disco intervertebral para investigar sua fisiopatologia sem a necessidade de modelos animais. Em comparação com a cultura celular in vitro, a técnica de cultura de órgãos bioreatores mantém as células em seu microambiente biológico e biomecânico nativo, além do fornecimento de uma condição cultural controlável e reprodutível. Comece enxaguando toda a cauda bovina completamente com água da torneira para remover sujeira e cabelo na superfície, em seguida, mergulhe a cauda em solução de 1%betadina por 10 minutos para desinfetar a superfície.
Use um bisturi número 20 para remover o tecido mole da coluna caudal para facilitar a identificação dos discos interverteberais, ou IVDs. Remova os processos espinhosos e transversais das vértebras com um plier de remoção óssea. Corte transversalmente com alicates ósseos através do meio de cada corpo vertebral para obter segmentos individuais de movimento, em seguida, coloque os segmentos de movimento coletados em uma placa de Petri com uma gaze molhada na solução de Ringer.
Localize o IVD em vértebras movendo os segmentos de movimento suavemente, em seguida, identifique a localização da placa de crescimento tocando e encontrando o lado convexo da placa final óssea. Esfrie a lâmina da serra de fita com a solução de Ringer e use-a para fazer dois cortes paralelos na placa de crescimento dos IVDs, um de cada lado. Transfira os IVDs para uma placa de Petri limpa com gaze limpa molhada com a solução de Ringer.
Raspe o corpo vertebral e a placa de crescimento usando a lâmina do bisturi, deixando a placa final intacta. Posicione as duas superfícies planas e paralelas para o procedimento de carregamento e transfira os IVDs raspados para uma placa de Petri fresca com gaze molhada com a solução de Ringer. Meça a altura e o diâmetro do disco com uma pinça e limpe os coágulos sanguíneos no osso das vértebras com a solução de Ringer usando um sistema de lavagem de jatos.
Desinfeta os IVDs em PBS e estreptomicina de penicilina de 10% com tremor por 15 minutos. Enxágüe os antibióticos de alta concentração com PBS e estreptomicina de penicilina de 1%. Transfira os discos para câmaras ivd contendo cinco mililitros de cultura IVD médio e coloque-os no sistema bioreator com uma incubadora a 37 graus Celsius com 85% de umidade e 5% de dióxido de carbono.
Cultue os discos por quatro dias dentro de um sistema bioreator, mantendo diferentes condições de carregamento de acordo com os grupos experimentais. No grupo de controle fisiológico, cultura os IVDs com médio de glicose elevado utilizando um protocolo de carga de 0,02 a 0,2 megapascals e 0,2 hertz por duas horas por dia. No grupo patológico, cultura os IVDs com baixo meio de glicose utilizando um protocolo de carga de 0,32 a 0,5 megapascals e cinco hertz por duas horas por dia.
Entre os procedimentos de carregamento, coloque os IVDs em placas de seis poços com sete mililitros de cultura IVD para recuperação gratuita do inchaço. Meça a altura do disco diariamente com uma pinça após o período de inchaço livre e após o carregamento dinâmico para a duração experimental. Após o primeiro ciclo dinâmico de carregamento no primeiro dia, coloque diretamente os IVDs em uma placa de Petri em uma posição vertical e estabilize-os com uma pinça.
Injete TNF-alfa recombinante com uma agulha de insulina de 30 bitola lentamente a uma velocidade de aproximadamente 70 microliters por minuto nos IVDs do grupo patológico. Depois de injetar, puxe a seringa no meio para trás e puxe o êmbolo para criar um vácuo que impeça o vazamento da solução injetada e, em seguida, remova a seringa completamente do IVD. O carregamento degenerativo combinado com a oferta nutricional limitada e uma injeção TNF-alfa causou um aumento significativo na expressão genética dos marcadores pró-inflamatórios interleucina seis e interleucina oito no tecido NP após quatro dias de cultura.
A liberação de proteínas interleucinas no meio condicionado mostrou um aumento acentuado no grupo patológico no segundo e quarto dia. A redução da altura discal após o carregamento foi maior no grupo patológico em relação ao grupo fisiológico, e as diferenças foram mais acentuadas após os dias dois e três em comparação com o primeiro dia, indicando um efeito progressivo das condições degenerativas e inflamatórias. Uma técnica de dissecção padronizada é importante para modelos de cultura de órgãos integrais ivd reprodutíveis.
Um bioreator é necessário para aplicar cargas fisiológicas e degenerativas em IVDs para simular várias condições biomecânicas in vivo. Esta técnica pode ser aplicada em explantas de IVD humanas que é de alta relevância clínica. É um novo modelo pré-clínico para desenvolver tratamentos eficazes na degeneração do disco em estágio inicial.
