Bu protokol önemlidir, çünkü dört hücresel bölmeyi birbirinden, sitoplazmadan, çekirdekten, mitokondriden ve zardan ayırmak için bir yöntem sağlar. Sadece bu değil, aynı zamanda güvenilir sonuçlara sahip ölçeklenebilir, tekrarlanabilir bir prosedürdür. Bu tekniğin en büyük avantajı, dört hücresel bölmenin minimum deterjan kullanımıyla ayrılmasıdır ve bu da çok daha tekrarlanabilir, güvenilir bir fraksiyonasyon prosedürüne izin verir.
Sitozolik protein izolasyonu için, RPMI 1640'ta U937 hücrelerini, 37 santigrat derecede %10 fetal sığır serumu ve% 5 karbondioksit ile sekizinci hücrelere toplam altı x 10 oranında büyütün. Kültürü santrifüj edin ve oda sıcaklığındaki PBS'deki hücre peletini mililitre başına altı hücreye dört ila 10 arasında bir son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın ve kümeleri parçalamak için hafifçe pipetleyin. İkinci bir santrifüjlemeden sonra, peleti buz gibi soğuk lizis tamponu A'da, mililitre başına yedinci hücrelere iki x 10 arasında son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın.
Aşağı akış nükleer protein ekstraksiyonu için buz üzerindeki konik bir tüpe 7,5 mililitre hücre ekleyin ve kalan hücreleri santrifüjleme ile pelet edin. Peleti sitoplazmik izolasyon tamponunda, mililitre başına yedinci hücrelere iki ila 10 arasında son bir konsantrasyonda yeniden askıya alın, hücreleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe etmeden önce, kümeleri parçalamak için hafifçe pipetleyin. Kuluçkanın sonunda, hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve süpernatantı temiz bir santrifüj tüpüne aktarın.
Hücresel kalıntıları tortulamak için süpernatantı santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve hiçbir pelet gözlenmeyene kadar santrifüjleme sırasını tekrarlayın. Numune enkazdan arındırıldığında, sitozolik fraksiyon içeren süpernatantı dört santigrat derecede bir aya kadar saklayın.
Daha sonra, lizis tamponu A'da depolanan hücre peletini, mililitre başına altıncı hücrelere dört x 10 arasında bir son konsantrasyona kadar askıya alın. Hücre homojenizasyonu için, hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve fazla sayısallık ve sistolik kirleticileri gidermek için süpernatantı atın. Pelet, buz üzerinde 30 dakikalık bir inkübasyon için peleti buz gibi soğuk hücre homojenizasyon tamponunda, mililitre başına altı hücreye dört ila 10 arasında bir son konsantrasyonda yeniden askıya alın.
Bu arada, boncuk bazlı mekanik lizis için, soğuması için buz üzerinde 50 mililitrelik etekli bir tüpte 15 mililitre lizis tamponu B'ye 30 gram önceden yıkanmış paslanmaz çelik 3.2 milimetre boncuk ekleyin. Kuluçkanın sonunda, etekli tüpteki tamponu hücre süspansiyonu ile değiştirin ve hücreleri sekiz hızda beş dakika boyunca karıştırın. Lizisten sonra, homojenatı temiz bir tüpe aktarın.
Homojenatı santrifüj edin, ardından süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Numuneden kalan kalıntıları gidermek için, homojenatı belirtildiği gibi üç kez santrifüj edin ve her santrifüjlemeden sonra süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Son santrifüjlemeden sonra, ham mitokondriyal fraksiyonu izole etmek için, süpernatantı santrifüjleme için yeni bir tüpe aktarın.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve ham mitokondriyal fraksiyon içeren peleti buz üzerine yerleştirin. Membran fraksiyonunu izole etmek için, toplanan süpernatanı santrifüj edin ve süpernatantı attıktan sonra ham membran fraksiyonu içeren peleti buz üzerine yerleştirin. İzopiknik yoğunluk gradyanı saflaştırması için, ham mitokondriyal ve membran fraksiyonu peletlerini 200 mikrolitre lizis tamponu B ve 1.8 mililitre iyodiksanol içinde yeniden askıya alın.
Her numune için süreksiz bir iyodiksanol gradyanı oluşturmak için, önce numune başına sekiz mililitrelik açık, ince duvarlı ultrasantrifüj tüpünün altına bir mililitre% 15 iyodiksantanol ekleyin. Daha sonra, sıralı olarak, her tüpte% 15 iyodiksanol tabakasının altında bir mililitre% 20 iyodiksanol,% 25 iyodiksanol, bir mililitre% 30 iyodiksanol ve bir mililitre% 35 iyodiksanol alttan alta yerleştirin. Bir gradyanın alt tabakasının altına ham mitokondriyal pelet süspansiyonunun iki mililitresini ve ikinci gradyanın alt tabakasının altına ham membran pelet süspansiyonunun iki mililitresini ekleyin.
Her bir gradyanın üstüne bir mililitre% 10 iyodiksanol dikkatlice katlayın ve mitokondriyal ve membran fraksiyonlarını yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile saflaştırmadan önce% 10 iyodiksantal ilavesiyle tüpleri birbirlerinin 10 mikrogramı içinde dengeleyin. Ayırmanın sonunda, her numuneden görünür bantları toplamak için ince duvarlı tüplerin kenarını delmek için bir iğne kullanın. Nükleer protein izolasyonu için, lizis tamponu A'da asılı kalan hücrelerin 7.5 mililitrelik alikotunu santrifüj edin ve peleti pipetleme ve vorteks ile 800 mikrolitre buz soğuk hücre çözünürlük tamponunda yeniden askıya alın.
Nükleer proteinleri korurken, plazma ve organel zarlarını bozmak için buz üzerindeki süspansiyonu 30 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sonunda, hücre süspansiyonunu santrifüj edin ve mikrolitre Benzonaz başına bir birim ile desteklenmiş 800 mikrolitre buz gibi soğuk nükleer lizis tamponunda hafifçe pipetleme yaparak peleti yeniden askıya alın. Nükleer membranı bozmak için karışımı uçtan uca rotatörde dört santigrat derecede inkübe edin.
30 dakika sonra, nükleik asitleri kesmek için darbeler arasında beş saniyelik bir duraklama ile% 20 güçte beş saniye boyunca karışımı üç kez sonikleştirin. Son sonikasyondan sonra, homojenatı santrifüj edin ve pelet rahatsız etmeden süpernatantı nükleer fraksiyon olarak toplayın. Yoğunluk gradyanı saflaştırmasından sonra fraksiyonların her birinin batı lekesi, mitokondriyal fraksiyonun% 25 ve% 30 iyodiksanol tabakalarına lokalizasyonunu ve membran fraksiyonunun% 10 ve% 15 iyodiksanol tabakalarına lokalizasyonunu gösterir.
Batı kan analizi ayrıca, izole edilen her numunenin saf olduğunu ve hücrenin diğer kısımlarından proteinler tarafından kontaminasyondan arındırılmış olduğunu doğrulamaktadır. Ek olarak, her numunenin bant yoğunluğunun densitometrik analizi, verilerin tekrarlanabilirliğini ve istatistiksel önemini doğrulamaktadır. Fraksiyonasyonun yanlış uygulanması, hücresel bileşenlerin çapraz kontaminasyonuna neden olabilir.
Örneğin, sitozolik fraksiyondaki yüksek bir Histon H3 konsantrasyonu, sitozolik fraksiyonun yanlış açıklığa kavuşturulmasından kaynaklanabilir. İzopiknik yoğunluk saflaştırması sırasındaki arıza, membran fraksiyonunun kirlenmesine neden olabilir. Batı kan analizinden önce, fraksiyonların protein miktarına göre jel yüklemesine izin vermek için gerçekten protein içerdiğini doğrulamak ve prosedürün uygun şekilde uygulandığını doğrulamak için bir protein niceleme testi yapmak yararlı olabilir.
Sitoplazmik fraksiyonun bir pelet içermemesi çok önemlidir. Batı lekeleri veya ELISA'lar, belirli koşullar altında farklı proteinlerin hücre altı yerini analiz etmenize izin vermek için bu prosedürü takiben gerçekleştirilebilir. Bu teknik, hiperglisemi koşulları altında farklı hücre ölüm faktörlerinin kaçakçılığını analiz etmemizi sağladı.
Ve böylece, bizim için bu, hiperglisemik kaymanın apoptozdan nekroza geçiş mekanizmasına ışık tutmaya yardımcı oldu.
