Nötrofiller ölümcül olarak farklılaştırılmış hücrelerdir ve şu anda nötrofil biyolojisini tamamen yeniden kaplatacak hücre çizgileri yoktur. Bu nedenle, biyolojilerini incelemek için saf, inaktive edilmiş, sağlıklı ve taze nötrofiller elde etmek gerekir. Bu yenileme yöntemi, saf bir nötrofilik preparat elde etmek için yoğunluk gradyanı, tortulasyon, nazik lizizi birleştirir.
Kurulumu kolaydır, basit ekipman ve az pratik gerektirir. Bu yöntemin degrade katmanlama gibi teknik yönü, ustalaşmak için biraz pratik gerektirecektir, ancak degrade mükemmelleştirildikten sonra diğer adımlar bir esinti olarak gelmelidir. Buffy ceket, ambalaj ve laminar davlumbaz sterilize larak başlayın.
Daha sonra 50 mililitrelik bir tüpe 10 mililitre kan ekleyin. Bir gradyan temizleyicisi için kanı seyreltmek için% 5 FBS / HBSS ekleyin ve hacmi 35 mililitreye kadar makyaj edin. Kapağı kapattıktan sonra, karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin ve ardından kırmızı kan hücrelerinden yoksun tabanı elde etmek için tüpü baş aşağı tutun.
Kanın hemen altına 10 mililitre yoğunluk gradyanı ortamı ekleyerek ortamın ve kanın karışmamasını ve arayüzün keskin kalmasını sağlayın. Boruyu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 kez g'da döndürün ve freni devre dışı bıraktığından emin olun. Döndükten sonra, gradyanı bir üst serum plazma tabakasına, periferik kan mononükleer hücrelerinin orta beyaz halkasına, bulutlu yoğunluklu gradyan orta tabakasına ve kırmızı kan hücrelerinin üstünde beyaz ince nötrofil bandından oluşan bir alt peletine gözlemleyin.
PBMC'yi çıkarmak için, emme pipetini doğrudan PBMC tabakasına çıkarın ve halka çıkarıldıkça serum plazma tabakası azalırken tamamen aspire edin. PBMC'nin çıkarılmasını en üst düzeye çıkarmak için tüpün yan tarafını emme pipeti ile kazıyın. PBMC halkası ile nötrofil/RBC pelet arasındaki bulutlu yoğunluk gradyan orta tabakasını dikkatlice çıkarın.
Eritrosit sedimamentasyonu için, nötrofil / RBC peletini temiz bir tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından 25 mililitrelik son hacme %5 FBS/HBSS ekleyin. Suya%3 dektran/%0,9 NaCl içeren önceden ısıtılan çözeltinin 25 mililitresini doğrudan boruya ekleyin ve ters çevrilerek hafifçe karıştırın.
Tüpü 15 dakika boyunca düz ve titreşimsiz bir yüzeye yerleştirin. Tüpü tekrar davlumbazın içine yerleştirdikten sonra, pipetleri sıvıya hafifçe daldırın ve sıvı yüzeyi aşağı doğru takip ederek üst tabakanın yaklaşık 30 mililitresini toplayın. Medyada yüzen parçacıklar olmadan kırmızı bir pelet elde etmek için tüpü döndürün.
Artık RBC'nin lizisi için, peleti bozmadan süpernatantı hafifçe aspire edin. Doğrudan tüpe 25 milimetre steril ultra saf su ekleyin ve RBC'yi lyse etmek için tüpü 28 saniye ters çevirerek hafifçe karıştırın. Daha sonra, hemen suya hazırlanan 25 mililitre steril% 1.8 NaCl çözeltisini tüpe ekleyin ve çözeltiyi nazik bir şekilde karıştırarak izotonik koşullara geri getirin.
RBC ve trombositlerin nötrofillerle tortulasyonunu en aza indirmek için tüpü düşük bir frenle üç ila beş dakika boyunca 200 kez g'de döndürün. Beyaz nötrofil peletin yeniden dirilirken, doğrudan peletin üzerine kültür ortamını ekleyin, ancak yukarı ve aşağı pipet yapmayın. Ardından, hücre aktivasyonunu en aza indirmek için tüpü bir yandan diğerine yatay olarak sallayın.
Hücre toplama veya topaklanma görülürse, kümelenmiş nötrofilleri atmak için hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir ağ üzerinden filtreleyin. İzole nötrofil preparatının kalitesini değerlendirmek için hücreleri nötrofillere, eozinofillere ve aktivasyon işaretleyiciye özgü belirteçlerle lekeleyin. Akış sitometrisi ile 20.000 hücre elde ettikten sonra, gating stratejilerini kullanarak hücre saflığını ve aktivasyonunu analiz edin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi Annexin V/propidium iyodür kullanarak hücre canlılığını belirleyin.
Düşük hızlı yoğunluk gradyanı daha saflıkta nötrofiller getirirken, yüksek bir hız saflık pahasına verimin artmasına neden oldu. Floresan ile aktive edilen hücre sıralamasını kullanarak, hücre dağılımı tek başına hücre izolasyon kalitesinin bir tahminini sağladı, ancak belirli hücre işaretleyicilerinin kullanımı tercih edilmelidir. Tanımlanan kontamine hücre popülasyonları monositler, lenfositler ve eozinofillerdi.
Muazzam nötrofil verimi bu protokol kullanılarak elde edildi. CD62L ifadesi değerlendirildi. CD62L için ortalama floresan yoğunluğu pozitif kontrol hücrelerinde cd62L dökülme ve nötrofil aktivasyonunu gösteren azaldı.
Nötrofillerin yarı ömrü nispeten kısa olduğu ve aktivasyonun ömrü daha da kısalttığı için nötrofil sağlığı test yapılmadan önce değerlendirilmelidir. Yoğunluk gradyanı ve ticari mikrobeadlar kullanılarak nötrofil saflaştırmadan sonra hücreler 24 saat kültürlendi ve hücre sağkalımı akış sitometrisi ile analiz edildi. Canlı hücrelerin nicelemesi, yoğunluk gradyan saflaştırmasının 24 saat sonra bir kit kullanılarak saflaştırmadan daha canlı hücrelerle sonuçlendiğini gösterdi.
Degrade katmanlama ve santrifüjleme adımlarının mümkün olduğunca iyi yapılması, preparatın kalitesini büyük ölçüde etkileyecektir. Bu işlemi takiben in vitro deneyler ve biyokimyasal tahliller yapılabilir. Ayrıca, sitokin ve protein ekspresyon deneylerinde olduğu gibi ultra saf hücreler gerekiyorsa negatif seçim yapılabilir.
