Bu çalışma, Wellcome Trust ve İngiliz Kalp Vakfı tarafından finanse edildi.

Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. 1. Doğum sonrası Eyes enükleasyon ve Fiksasyon <ol><li> Yan yavru insanca öldürüldü fare yerleştirin, makas ile göz kaplayan deri kaldırmak. </li><li> Göz tanıttılar makas ve forseps kullanın. </li><li> Enüklee göz altında yer makas, optik sinir ve çevresindeki dokuları kesmek ve göz çıkarın. Oda sıcaklığında, 2x PBS içinde oluşur% 4 paraformaldehit (PFA), ihtiva eden bir 24-kuyucuklu plakaya aktarılır. </li><li> Her bir göz için 10 düzeltmek için - 10 dk - 15 dk, daha sonra 5 için buz üzerinde soğuk 2x PBS transfer. Bu sabitleme derecesi her bir göz için eşit olduğundan emin olmak için enucleations ve sonraki sabitleme sendeleyip en iyisidir. </li></ol> 2. Doğum sonrası Murin retina diseksiyonu <ol><li> 2x PBS içeren bir Petri kabı içine transferi gözleri bir disse altında delik ve yer genişletmek için kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarakmikroskop cting. </li><li> Forseps ve makas kullanılarak göz çevresinde herhangi bir yağ çıkarmak. </li><li> Pierce keskin bir makas ile korneanın kenar ve kornea ve iris ve atın etrafını kesin. </li><li> Retina ve sklera arasında forseps yerleştirin ve retina gözyaşı özen sklera çıkarın. Koroid tabakası da kaldırılabilir, ancak bu adımı sırasında meydana gelen retinaya hasar riski varsa, koroid tabakası önemli ölçüde immün kalitesini etkilemez olarak bırakılabilir. </li><li> Lens ve forseps kullanarak vitreus mizah çıkarın. </li><li> Ince forseps ile gözün merkezinde bir araya toplayarak hyaloids gemilerin çıkarın sonra hızlı bir şekilde retinanın merkezi (alternatif olarak ince makas ile hyaloid gemilerin dibinde kelepir) uzak çekin. </li><li> Temiz bir Petri kabındaki PBS ile fincan şeklinde retina durulayın. </li><li> Bahar scisso kullanarak retinanın yarıçapı yaklaşık 2/3 ulaşan 4 ile 5 radyal kesiler olunrs bir &#39;taç yaprağı&#39; şekil oluşturmak için. </li><li> PBS retina düzleştirmek için bir Pasteur pipeti kullanarak, ve sonra emici kağıt küçük bir parça ile herhangi bir aşırı PBS kaldırmak çekişi. </li><li> Yavaşça pipet soğuk (-20 ° C) retina yüzeyine damla metanol damla tamamen ek metanol ile daha sonra sel kaplı ve kadar. Bu retina düzeltmek için ve permeabilization kolaylaştıracaktır yardımcı olacaktır. Retina beyaz dönecek. </li><li> Delik genişletmek için kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarak 2 ml tüp aktarın. </li><li> Immün devam etmeden önce en az 20 dakika soğuk metanol içinde retina bırakın. Burada kullanılan antikorlar, sadece VE-kaderin metanol sabit retina üzerinde başarılı bir şekilde kullanılamaz. Bu durumda retina adım 9 sonra immün doğrudan devam etmek gerekir. </li><li> Gerekirse kadar boyamadan önce bir kaç ay için, retinalar -20 ° C&#39;de metanol içinde saklanabilir. </li></ol> 3. Immuno / Retina Vascu bir isolectin Boyamalature <ol><li> Dikkatle çıkarın / metanol dökün ve yavaşça (bu aşamada retina yukarıdaki adım 11 ile aynı 2 ml&#39;lik bir tüp içinde hala) PBS içinde kısaca retina yıkayın. </li><li> Perm / Blok çözüm 100 ul PBS ve kapak retina çıkarın (PBS +% 0.3 Triton +% 0,2 BSA) + 5 uygun serum% (bkz. Tablo 1) ve 1 saat için hafifçe sallayın. </li><li> Nazik 4 gece sallayarak ° C 100 seçilen primer antikor ul (bkz. Tablo 1) ve / veya IsolectinB4, Perm / Blok seyreltilmesi ile hazırlanan tüm ile retina Blok ve inkübe / Perm çıkarın. </li><li> Antikor / isolectin çıkarın ve retina 4 yıkayın PBS x 10 dk +% 0.3 Triton (PBSTx). </li><li> Bazı durumlarda, IsolectinB4-Alexa488 konjüge ya da doğrudan primer antikor ile örneğin aşağıdaki boyama, ikincil antikorun gerekli değildir ve retina (basamak 7) doğrudan monte edilebilir. Konjuge olmayan bir primer antikor, uygun florun 100 ul, daha sonra adım 3&#39;te kullanılan görmüşseescent ikincil antikor (PBSTx içinde 1/200 seyreltilmiş) ilave edildi ve 4 ° C sıcaklıkta ya da oda sıcaklığında, 4 saat süreyle gece boyunca inkübasyona bırakılmıştır. </li><li> Ikincil antikor çıkarın ve 2 ml PBSTx içinde retina 4 x 15 dakika yıkayın. </li><li> Geniş bir delik plastik Pasteur pipeti kullanarak slayt üzerine retina aktarmak ve emici dokusu ile fazla PBSTx çıkarın. 50 ul ekleyerek Dağı retina retina üzerinde lamel ve yavaşça konumu üzerine mountant uzatır. </li><li> Transferi onlar uzatmak mountant ayarlamak için izin vermek için, düz ve ışıktan korumalı olmasını sağlamak, 4 ° C gecede buzdolabı kayar. </li><li> Görüntü retina bir konfokal mikroskop veya Epifloresans mikroskop kullanılarak. </li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinal+vasculature.">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li><li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses.">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping.">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+expression+of+TGFbeta+type+II+receptor+is+required+to+maintain+vascular+integrity+during+postnatal+development+of+the+central+nervous+system.">Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system.</a> PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).</li><li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+arteriovenous+malformations+in+the+absence+of+endoglin.">Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin.</a> Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia.">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada sunulan yöntem anjiogenezin kolay ölçülebilir ve fizyolojik ilgili model yapımı, yenidoğan fare retina lekeli bütün montaj hazırlıkları görüntüler elde etmek için basit ve etkili bir yol sunar. Başlangıçta, fare göz küçük boyutu ve dünya şekli nedeniyle incelemek için oldukça zor olabilir, biraz pratik ve iyi diseksiyon araçları güvenilir sonuçlar için gereklidir bu yüzden. Bu göz su kaybı küçük bir miktar neden olur ve diseksiyon kolaylaştırır içi yörünge basıncı aza...

Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının oluşumu ile tanımlanan ve çok sayıda sinyal yolları ile düzenlenmiş olan karmaşık bir gelişimsel bir süreçtir. Bunların en önemli VEGF yoldur. VEGF komşu kan damarlarında çimlenme anjiyogenik en başlamadan iskemik hücreleri ve yol tarafından serbest bırakılır. Filiz yeni bir damar önde gelen endotel hücre VEGF kaynağına doğru ulaşmak olduğunu filopodia üreten bir &#39;ipucu&#39; hücre, ve &#39;sap&#39; endotel hücreleri prolifere takip eder. Bu şekilde, aktive edilmiş endotel hücreleri göç eder ve bunlar, yeni damar tüpler oluşturmak burada avasküler bir bölge doğru çoğalır. Kan akışını desteklemek için bu tüpler stabilize etmek amacıyla, endotelial hücreler perisitler ve yeni kan damarlarının 1 çevreleyen yumuşak kas hücreleri ile etkileşime girer. Anjiyogenez, embriyo ve artan doku vaskülarizasyonu için gereklidir. Bununla birlikte, aynı zamanda pek çok patolojik katkıdakanser gibi kalori bozuklukları; anjiyogenez bozukluklar iskemik hastalıkları ile ilişkili ise. Hastalığın tedavisi için bir araç olarak anjiyojenez düzenleyen etkili ilaç tedavilerinin geliştirilmesi büyük ilgi taşımaktadır. Örneğin, etkili bir anti-anjiyojenik faktörler, kanser büyümesini azaltmak pro-anjiyogenik stratejiler iskemik bir hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir iken olacaktır. Böylece, anjiyogenez modelleri daha iyi yeni damar oluşumu ve vasküler büyüme artırmak veya azaltmak için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için düzenleme anlamak için gereklidir. Anjiyogenez araştırma temel bir unsuru uygun bir damar modelinin seçimdir. In vitro modellerde pek çok tür endotel hücre göçü, çoğalması ve hayatta kalma 2,3 olarak anjiyogenez temel adımları yeniden tasarlanmıştır. Sıklıkla in vitro tahlilinde kullanılan bir rağmen t bir Matrigel matrisi üzerinde endotelyal hücre, bir dallı bir şebeke oluşumuonun endotel hücreleri için spesifik değildir, ne de genellikle perisit ve düz kas hücrelerinin destek dahil etmez. Bu tür vücut embriyoit tahlilinde, aortik halka deneyi ve fetal metatarsal deneyi gibi fare organ kültürü ile ex vivo olarak filizlenme anjiyogenez Değerlendirilmesi ek destek hücreleri bağlamında endotel hücrelerinin damar analizine izin verir. Bununla birlikte, bu testler, ana sınırlamaları analiz için sınırlı bir pencere vererek, kan akışının olmaması ve zaman içinde damarlarının regresyon içerir. Bu nedenle, daha doğru bir anjiyogenez düzenleme anlamak için, in vivo modellerde de arka kol veya bacak iskemisi model olarak, örneğin deri altına implante edilen sünger veya fişleri Matrigel kullanılarak fare geliştirilenlerdir olarak gereklidir. Ancak, bu modeller neovessels karmaşık 3D mimarisi nedeniyle analiz etmek zordur. Buna karşılık, zebrabalıkları embriyo tamamının görüntülenmesi anjiyogenez için mükemmel bir model olduğunu kanıtlamıştırorganizma 4. Bununla birlikte, fare, fare birçok durumda, tercih edilen bir model yapımı evrimsel olarak çok daha yakından zebrabalıkları göre insan ile ilgilidir. Sonuç olarak doğum sonrası fare retinanın anjiyogenez anjiyogenez araştırmalar için tercih edilen bir iyi karakterize yöntem temsil eder. Bu fizyolojik bir ayar, aynı zamanda kolayca uygun floresan lekeleri kullanılarak görüntülendi edilebilir bir 2D vasküler pleksus sağlar sadece. Damar ağı, endotel proliferasyonu, çimlenme, perivasküler hücre toplanması ve gemi yeniden bir mimarisi tüm bu teknik kullanılarak incelenebilir. Neonatal fare retinasında, retinal kan damarlarının gelişimi Postnatal ilk haftasında meydana gelir. Fareler, insanlar farklı, kör doğarlar ve retina sadece doğumdan sonra vaskülarize olur. Retina damarları doğum sonrası gün 0 (P0) de optik sinir retina yakın merkezinde kaynaklanan ve son derece düzenlemek oluşturmak için anjiyogenez tarafından geliştirmekyaklaşık P8 5 ile retina çevre ulaşır d vasküler pleksus. Kan damarları kılcal pleksus yavaş yavaş bir araya kapiller ağı ile arterler ve venler düzenli bir alternatif desen oluşturmak için çevre doğru optik disk dışarı doğru büyüyen karakteristik bir şekilde gelişir. Retina damar böylece nispeten kolay düz montaj hazırlıkları 5 retina damar incelemek için yapım, onlar aslında bir 2D düzlemde ne de büyüdükçe damarlar kolayca tespit edilebilir olarak anjiyogenez çalışmak için ideal bir model sağlar. Birkaç saat ex vivo olarak endotelial fazla uç hücre yanıtlarının analizi için Yeni doğan fare retina izole edilmesi için bir yöntem olup 6 bildirilmiştir. Alternatif olarak, tüm retina damar ve ilişkili vasküler işaretleri daha ayrıntılı bir araştırma farklı gelişim aşamalarında sabit retina örneklerinin immün gerektirir. Burada sağlamakBiz mikroskop altında son görüntüleme için boyama protokolleri ile (ayrıca 7) doğum sonrası gözün ilk enükleasyon gelen fare retina vasküler pleksus, ve tüm montaj boyama için kullandığınız güvenilir ve teknik yalındır yöntemi ayrıntılı bir açıklama.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 3 ml</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>PIP4210</td>
			<td>Remove tip with scissors to create a wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 24-well plates</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>353226</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Petri dishes TV 90 mm</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1336</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td>Used for enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal clear' tubes 2 ml</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1420-2000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make up in 2x PBS and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti-fade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Detects astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>04-585</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Detects vascular basement membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Detects vascular smooth muscle cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550546</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550548</td>
			<td>Detects endothelial cell junctions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alk1 (goat polyclonal)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF770</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Secondary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11058</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRc</td>
			<td>Camera for dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioimager with Apotome</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRm</td>
			<td>Camera for Axioimager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo

Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının filizlenmesi tarafından tanımlanan yeni kan damarı oluşumunu ve karmaşık bir süreçtir. Anjiyogenez, kanser, körlük ve iskemik hastalıklar gibi kan damarı oluşumunu düzensiz olduğu birçok hastalık, aynı zamanda, sadece organ ve dokuların normal gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır, ancak. Anjiyogenez hastalığında özellikle yeni damar oluşumunu denemek ve düzenlemek için yeni ilaç gelişimi için önemli bir hedef bu yüzden yetişkin yaşamda, kan damarları genellikle sakin olan. Daha iyi anjiyogenez anlamak ve düzenlemek için uygun stratejiler geliştirmek amacıyla, modeller doğru dahil olan farklı biyolojik adımları yansıtan gereklidir. Damar sertliği, damar ve kılcal doğumdan sonraki ilk hafta içinde vasküler pleksus oluşturmak için geliştirmek için fare yenidoğan retina damar mükemmel bir model sunar. Bu model aynı zamanda, iki-di sahip olma avantajına sahiptirmensional (2B) yapısı diğer damar ağları karmaşık 3D anatomisi ile karşılaştırıldığında basit analizi yapma. Doğum sonrası farklı zamanlarda retinal vasküler pleksus analiz ederek, bu mikroskop altında anjiogenez çeşitli aşamalarında gözlemlemek mümkündür. Bu makalede, isolectin ve vasküler spesifik antikorlar ile floresan boyama kullanılarak bir fare retina damar analiz etmek için basit bir işlem ortaya koymaktadır.

Diseksiyon sonra retinanın düz çiçek (Şekil 1) gibi görünmelidir. Yukarıda belirtilen protokol kullanılarak, endotel hücrelerinin, anti-a-düz kas aktin (Şekil 2) kullanılarak görselleştirilmiştir isolectin B4-Alexa488 boyaması kullanılarak ve vasküler kas hücrelerinin destek görülebilir. Şekil 2&#39;de bir 5X objektif kullanarak düşük güç görünümü retinanın damar örgütün genel bir bakış sağlar. Ayrıca, yukarıda verilen protokol a...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo at JoVE.com

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli sağlar<em&gt; In vivo</em&gt; Bağlam. Doğru vasküler pleksus görselleştirmek için immunofluorescent boyama çalışmaları bu tür başarısı için çok önemlidir.

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

whole-mount-immunofluorescent-staining-neonatal-mouse-retina-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

45.4K Görüntüleme.  Newcastle University. Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli sağlar In vivo Bağlam. Doğru vasküler pleksus görselleştirmek için immunofluorescent boyama çalışmaları bu tür başarısı için çok önemlidir.

Video: Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Nörobilim

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

Mantar Formu, Sirkülasyon ve Damak Tat Tomurcuklarının Bütün Montajlı Boyama, Görselleştirme ve Analizi

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

Methods Article

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama