Bu çalışma NIH den 115.347-RSG-08-271-01-GMC ACS ve CA138631 tarafından hibe tarafından desteklenmiştir.

Protokol başlangıçta B. Ren, 2001 uyarlanmıştır. Odom ve arkadaşları tarafından protokol hafif bir değişiklik temsil eder. Bulunabilir 5 <a href="http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads">http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&amp;f=appendices_downloads</a> 1. Ön-blok ve manyetik boncuk antikor bağlayıcı (sonraki adım, bir gece önce uygulanmalı) <ol><li> 1 ml taze BSA / PBS solüsyonu (50 mg 10 ml BSA PBS-Bu çözüm, bir hafta boyunca sürecek). Dynabeads Protein G 100 mcL yıkayın (IP başına birden fazla IP adresleri için, birleştirmek) </li><li> Manyetik bir stand boncuklar kullanarak toplayın ve yıkama işlemi iki kez daha tekrarlayın. </li><li> Sonra, ul PBS / BSA çözüm boncuk bulamaç (IP başına) 250 10 mikrogram antikor ve 4 geceleme dönen bir platform üzerinde inkübe ° C </li><li> Tamamlandığında, PBS / BSA çözüm 1 ml boncuk üç defa yıkamak ve sonra PBS / BSA çözüm (IP başına) 10 ul tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 2. Hücre çapraz bağlama <ol><li> Bu yordamı başlamak için, yaklaşık 10 8, her immunoprecipitation hücre, ya da IP büyür . Burada, diffüz histiyositik lenfoma U937 hücrelerinin kullanılan ve 96 saat TPA ile monositik farklılaşma için uyarılan. </li><li> Hücre büyümesinin ardından, doğrudan nihai konsantrasyonu% 1 ortam formaldehit ekleyin. Daha sonra, onları 10 dakika boyunca oda sıcaklığında oturup girdap şişeler kısaca ve izin verir. Sonra, medya aspire hücreleri ve buz gibi soğuk PBS 15 ml ile durulayın. Bu yıkama bir kez tekrarlayın. </li><li> Daha sonra, her 6 Lizis Tampon 1 ml (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA,% 10 gliserol,% 0,5 &#39;NP-40, Triton proteaz inhibitörleri içeren X-100,% 0.25) buz üzerinde şişe. Daha sonra, 4 için en az 20 dakika şişeler kaya ° C </li><li> Son olarak, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücrelerin hasat ve 15 ml konik tüpler aktarabilirsiniz. Bu noktada hücreler, -80 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol> 3. Hücre Sonikasyon <ol><li> Hücreler dondurulmuş olsaydı, onları Çözülme. Çözülmüş sonra, 10 dakika 3.000 rpm&#39;de 4 hücreleri aşağı dönmeye ° C ve supernatant atın. Sonra, Lizis Tamponu 2 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 1mm EDTA, 0.5 mM EGTA, proteaz inhibitörleri içeren) mL 6 hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça Rock tüpler. </li><li> Santrifüj tekrarlayın ve 2.5 mL Lizis Tampon 3 (proteaz inhibitörleri içeren 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA,% 0,1 sodyum deoksikolatın, 0,5% N lauroylsarcosine,) hücrelerin tekrar süspansiyon . </li><li> Sonra, 50 ve% 60 genlik arasında bir Branson 450 Sonifier mikrotip buzlu su behere koyarak sonication için süspansiyon hazırlamak. </li><li> Çözüm için, 1 dakika buz üzerinde 30 saniye sabit bir patlama ve serin sonikasyon. Bu bakliyat, 10 ila 15 kez tekrarlayın. Daha sonra, tüpün içeriğini pipet ve aşağı ve yeni bir tüp aktarabilirsiniz. Ek bir 5 kez nabız ve çözüm soğutmak için devam edin. </li><li> Sonication ardından,% 10 Triton X-100 çözümü hacminin 1 / 10. 1,5 mL santrifüj tüplerine lizatları aktarın ve bir mikrosantrifüj enkaz döndürün. Sonra yeni bir tüp hücre lizat aktarın. </li></ol> 4. Kromatin Immunoprecipitation <ol><li> Kromatin immunoprecipitation veya ChIP önce giriş örnek olarak hücre lizat 50 mcL kaydedin. Sonra, Dynabeads yukarıda açıklandığı gibi önceden hazırlanmış antikor ön bağlı temizlenir hücre lizat birleştirir. 4 ° C gecede, 50 mcL giriş örnek ek olarak, Rock karışımı. </li><li> Yıkama Tamponu 1 mL (50 mM Hepes KOH, pH 7.6, 0.5 M LiCl, 1mm EDTA,% 0.7 sodyum deoksikolatın,% 1 NP-40) ile boncuk yıkayın. Daha sonra manyetik bir stand, boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak için kullanın. Bu yıkama 6 ila 8 kez tekrarlayın. </li><li> Ile son yıkama gerçekleştirin 1 ml TE-artı-50 mM NaCl (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA). 2 dakika 3.000 rpm&#39;de mikrosantrifüj boncuk Spin 4 ° C Santrifüj sonrasında, herhangi bir kalıntı TE tampon aspirat. </li><li> Sonra, örnekleri Elüsyon Tampon (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA,% 1 SDS) 100 mcL ekleyin. Hemen sonra, 65 numunelerin inkübasyon ° C&#39;de 10 ila 15 dakika. Süspansiyon boncuk tutmak için 1.5 ml tüp raf her 2 dakikada karşı tüpler kazıyın. </li><li> Santrifüj ve manyetik standı kullanarak boncuk toplamak ve PCR tüp süpernatantı transfer. Sonra, önceden kaydedilmiş bir giriş örnek almak ve Elüsyon Tampon 3 cilt. </li><li> Son olarak, 65 gece termal cycler içine IP ve giriş örnekleri yerde ° Cçapraz bağlantıların ters. </li><li> Ertesi gün, örnekleri TE tampon 1 hacim ekleyin. Daha sonra, nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml RNaz A ekleyin. 37 için 1 ila 2 saat termal cycler örnekleri inkübe ° C </li><li> Inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 0.2 mg / ml proteinaz K ekleyin. Daha sonra, 2 saat boyunca termal cycler numune 55 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Sonra, fenol ile bir kez, bir ses örnekleri ayıklayın. Kloroform: izoamil alkol, fenol, bir ses örnekleri ikinci kez ayıklayın. Izoamil alkol: Son olarak, bir kez daha bir hacim kloroform örnekleri ayıklamak. </li><li> Sonra, her bir örnek için 30 mg glikojen ekleyin. Ayrıca, numunelerin etanol 0.2 Molar ve iki ciltlik bir son konsantrasyonu NaCl ekleyin. 30 dakika inkübe -80 ° C Inkübasyondan sonra, numuneler ve spin süpernatantı süzün. Pelet 500 mcL% 75 etanol ile yıkayın. Sonra, pelet ve kuru onlara su 40 mcL yeniden askıya. </li><li> Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutları kontrol etmek için,% 1.8 agaroz jel 5 mikrogram, arıtılmış giriş örnek jel yüklemek ve çalıştırmak. Sonication prosedürü aralığı 150-350 baz çifti parçaları üretmek gerekir. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değiştirerek ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> 1 IP örneklerinin ul ve seyreltme serisi ile girdi örnek bir gen-spesifik PCR gerçekleştirerek kontrolü bağlayıcı bölgelerde zenginleştirme ChIP sağlamlık ve özgünlüğü kontrol için. IP ve giriş örnekleri kalitesini test etmek için iki ya da üç &quot;bound&quot; bölgeler ve ilişkisiz bir kontrol bölgesi seçilmesi gerekir. </li></ol> 5. Genomik DNA amplifikasyonu <ol><li> IP giriş numune numune veya 200 ng 34 ul ile başlayarak, son onarım, Genomik DNA Sample Hazırlık Seti kullanarak DNA parçalarının &#39;A&#39; kuyruk ek ve adaptörleri ligasyonu gerçekleştirmek <a href="http://www.illumina.com/systems/genome_analyzer.ilmn">http://www.illumina.com/systems/ genome_analyzer.ilmn</a> (Illumina, Inc, San Diego, CA). </li><li> MinElute PCR Arıtma kiti kullanılarak DNA arındırmak ve daha sonra 50 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış edildiğini tampon EB (10 mM Tris Cl, pH 8.5) Zehir Örneğin, sırasıyla, IP ve giriş DNA örnekleri son yürütülmesi için 23 mcL ve 46 mcL kullanın. </li><li> 20 mcM Sol_PCR_2 mcL adaptörleri ile DNA&#39;nın 23 mcL kullanarak PCR ve kit 25 mcL Phusion DNA polimeraz, 20 mcM Sol_PCR_1 1 mcL, ve 1 yapın. PCR reaksiyonu aşağıdaki gibi çalıştırın: 98, 2) 10 saniye 98 ° C, 3) 30 saniye 65 ° C ° C 1) 4) 30 saniye 30 saniye 72 ° C; adımları yineleyerek adım 2-4 18 72 kez ve daha sonra 5 dakika ° C, son olarak 4 tutarak ° C </li><li> PCR ardından QIAGEN MinElute PCR Arıtma Kiti ile DNA arındırmak. Ön tampon EB-50 sıcak 15 mcL ° C ve DNA Zehir. Örnek 01:04 0.5 mcL seyreltilir ve bir Nanodrop okuma yapmak. </li></ol> 6. Amplifiye ürünlerin Jel arıtma <ol><li> Çoğaltılan ürünlerin arındırmak için, HPLC-sınıf su kullanarak 50 ml% 1.8 agaroz jel hazırlayın. TAE ve etidyum bromür agaroz erimesinden sonra ekleyin. Daha sonra, jel dökün. Giriş ve IP örnekleri yükleme tamponu 4 mcL ekledikten sonra jel yükleyin. Daha sonra, 45 dakika için 120 volt jel çalıştırın. </li><li> Çalıştırıldıktan sonra jel analiz edin. Jel, 150 ve 350 baz çifti üretilir aralığında o parçaları ortaya çıkarmak gerekir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. </li><li> Vergi bir neşter ile 150 350 baz çifti aralığı madde içeren jel bölgesi. Adaptörü adaptörü bant eksize önlemek için dikkat edin, yaklaşık 120 baz çifti çalışır. Üreticinin talimatlarına göre bir QIAquick Jel Ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA kurtarın. Özellikle QIAquick Jel Ekstraksiyon Kit, 400 mg veya daha az bir jel dilim için bir sütun kullanabilirsiniz. Ekstraksiyon işlemine başlamak için 3 cilt, 1 hacim jel tampon QG ekleyin. 1 hacim izopropanol ekleyin ve sütun karışımı yük. 0.5 ml QG sütun yıkamak için kullanın, kiti kılavuzda açıklanan standart prosedür takip etti. H 2 O önceden ısıtılmış 50 ° C DNA Zehir. 37 az 5 dakika 30 H 2 O ul sütun ° C&#39;de aşağı iplik önce. </li><li> Kuru ısı olmadan Speedvac tam 11 mcL aşağı örnek. Örnek 1 mcL çıkarın ve Nanodrop spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçmek. </li><li> Son olarak, açıklanan Illumina Genom AnalyzerIIe kullanarak zenginleştirilmiş gen ürünleri belirlemek <a href="http://genesdev.cshlp.org/content/suppl/2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf">http://genesdev.cshlp.org/content/suppl</a>6 / 2008/12/15/22.24.3403.DC1/GuentherSuppMat.pdf. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Aşağıdaki deneme genel amacı KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase genomik hedefler belirlemektir. (P1) Bu, uygun büyüklükte DNA parçaları üretmek için sonicated, çapraz bağlantılı kromatin hazırlanması ile elde edilir. (P2) ikinci bir adım olarak, RBP2 bağlı DNA parçaları RBP2 antikorlar immunoprecipitated. Sonraki (P3), kurtarılan DNA parçalarının ucunda tamir ve adaptörleri Illumina Küme Station akış hücreleri genomik DNA analizi için kütüphaneler hazırlamak için genomik DNA ucu üzerine bağlandı. DNA kütüphaneler döngü az sayıda kullanarak PCR ile güçlendirilir. (P4) Son olarak, aydınlatıcı sıralı kısa benzersiz insan genomu hizalanır okur, önemli zirveleri RBP2 zenginleştirilmiş bölgeleri tanımlamak için tanımlanan ve en yakın genlere açıklamalı vardır. (P5) Sonuçlar RBP2 zenginleştirilmiş bölgelerin genom kimlik dayalı RBP2 hedef genleri ile ilişkili moleküler fonksiyonları elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutlarını kontrol etmek için kromatin sonication sonuçlarını kontrol etmek, 5 mg (1 / 10), saflaştırılmış giriş numunenin% 1.8 agaroz jel üzerinde yüklenmiştir . Beklendiği gibi, bizim sonication işlem aralığı 150-350 bp parçaları üretti. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değişen, buna göre ayarlanabilir olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Amplifiye ürünler Jel arıtma PCR ürünleri adaptörleri kaldırmak ve küme yeni nesil platform için şablonlar bir boyut aralığı seçmek için bir jel üzerinde çalıştırılır. Bu jel, 150 ve 350 baz çifti aralığında üretilen parçaları olduğunu gösterir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. Bir neşter ile jel tüketim Seçili bölge. Bakım yaklaşık 120 baz çifti çalışır adaptörü adaptörü bant önlemek için alınmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. Izoform-spesifik antikor RBP2 büyük ve küçük izoformları arasında ayırım sağlar. RBP2 protein yapısı etki alanı görünümünde sunulmaktadır . Katalitik histon demetilasyon JmjC etki alanı ve ilişkili JmjN etki, sekans spesifik DNA bağlanmasını, potansiyel DNA veya diğer proteinler ve çok sayıda PHD alanlarını ile etkileşime girebilir C5HC2 çinko parmak yeteneğine sahip bir KURAK etki alanı: RBP2 birkaç etki alanı içerir. RBP2 izoformları arasında ayırt izin iki anti-RBP2 antikorlar, kalın çizgi ile gösterilen RBP2 parçaları karşı elde edilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5a.jpg" alt="Şekil 5a" /> Şekil 5a. Kromozom ve Ensembl genleri ile birlikte RBP2 bağlayıcı bölgelerin Genel Bakış. Genomik koordinatları (tüm izoformlarını ve büyük izoformu) bağlayıcı bölgeleri tespit zenginleştirilmiş RBP2 kromozom bilge sunulmaktadır. Ensembl genler Occupances (sürüm 54; hg18) kromozomlarda (Bu resim 10 kromozom) siyah çubuklar (üst panel) olarak sunulmuştur. Her RBP2 bağlayıcı bölgenin orta paneli tüm RBP2 izoformları kromozom 10 üzerinde bağlayıcı bölgeleri gösterir dikey bir çizgi olarak temsil ve alt panel RBP2 büyük izoformu bağlayıcı bölgeleri gösterir. Orta ve alt paneller örtüşen bakış ve kromozom 10 RBP2 izoformları belirli doluluk verir. <img src="/files/ftp_upload/2101/2101fig5b.jpg" alt="Şekil 5b" /> Şekil 5b. RBP2 hedef genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizi. İlgi haritası FDR gösteren zenginleştirilmiş RBP2 (ve büyük tüm izoformları) (genler yakın RBP2 bağlayıcı bölgeye) bağlı genler arasında Moleküler Fonksiyon kategoriler GO (p-değeri ≤ 0.05) önemli ölçüde düzeltilmiş. Kırmızıya doğru renkler yüksek istatistik önemi gösterir, sarı düşük istatistik önemi gösterir ve gri hiçbir istatistik önemi gösterir. Zenginleştirme analizi RBP2 hedef genlerin birbiriyle örtüşen ve izoform spesifik moleküler fonksiyonları gösterir.

<ol>
	<li>Wang, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+malignancies+caused+by+dysregulation+of+a+chromatin-binding+PHD+finger.">Haematopoietic malignancies caused by dysregulation of a chromatin-binding PHD finger.</a> Nature. 459 (7248), (2009).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+pRB+to+the+PHD+protein+RBP2+promotes+cellular+differentiation.">Binding of pRB to the PHD protein RBP2 promotes cellular differentiation.</a> Mol Cell. 18 (6), 623-623 (2005).</li><li>Lopez-Bigas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+the+H3K4+histone+demethylase+RBP2+reveals+a+transcriptional+program+controlling+differentiation.">Genome-wide analysis of the H3K4 histone demethylase RBP2 reveals a transcriptional program controlling differentiation.</a> Mol Cell. 31 (4), 520-520 (2008).</li><li>Benevolenskaya, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3K4+demethylases+are+essential+in+development+and+differentiation.">Histone H3K4 demethylases are essential in development and differentiation.</a> Biochem Cell Biol. 85 (4), 435-435 (2007).</li><li>Odom, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303 (5662), 1378-1378 (2004).</li><li>Guenther, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+chromatin+at+genes+encoding+stem+cell+regulators+in+human+mixed-lineage+leukemia.">Aberrant chromatin at genes encoding stem cell regulators in human mixed-lineage leukemia.</a> Genes Dev. 22 (24), 3403-3403 (2008).</li></ol>

RBP2 izoformları arasında işlevsel farklılıklar tespit edilmemiştir. Biz RBP2 izoformları bağlı genomik bölgelerin belirlenmesi ve bu bölgelerde temsil ettiği fonksiyonel kategoride tanımlamak için kapsamlı bir yaklaşım kullandık. Bu elde edilen dizisi biyoinformatik analiz okur takip ChIP Seq analizi ile gerçekleştirildi. RBP2 histon kuyrukları metil lizin kalıntılarının değiştirir. Biz RBP2 büyük izoformu, insan genomu (Şekil 5A) farklı bölgelerinde bu modül bağlama eksik metil histon lisin ve RBP2 küçük izoformu için tanıma modülü içeren bulundu. Önemlisi, izoform belirli bölgelerde ve örtüşen bölgelerinde farklı moleküler fonksiyonları (Şekil 5B) ile genler aittir. Örneğin, &quot;kromatin bağlayıcı&quot; ve &quot;transkripsiyon faktörü bağlayıcı&quot; fonksiyonları RBP2 küçük izoformu gen hedefleri atfedilen olabilir ama değil RBP2 büyük izoformu (Şekil 5B). Gerçek gen karşılaştırarak büyük izoformu özellikle bazı genlerin işe ise tüm izoformları ve RBP2 büyük izoformu (veriler gösterilmemiştir) için, biz de tanımlayabilirsiniz oluşturulan ayarlar.

Oligonükleotid dizileri 2006 Illumina, Inc Tüm hakları saklıdır. <ul><li> Sol_PCR_1 Sıra 5&#39;-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li><li> Sol_PCR_2 Sıra 5&#39;-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T-3 &#39; </li></ul>

genome-wide analysis using chip to identify isoform-specific gene targets

Hedeflerine transkripsiyonel ve epigenetik faktörlerin İşe Alım kendi düzenlenmesinde önemli bir adım. Göze çarpacak belirli histon modifikasyonları bağlamak protein etki işe özellikli. Böyle bir etki birkaç kromatin bağlayıcı proteinler bulunan bitki homeodomain (PHD). Epigenetik faktörü RBP2 birden fazla PHD etki vardır, ancak, farklı işlevleri vardır (Şekil 4). Özellikle, bir insan lösemi RBP2 onkojenik füzyon bulunan C-terminal PHD etki alanı, histon H3 (H3K4me3) 1 lizin 4 trimethylated bağlanır. C-terminal PHD içeren RBP2 izoformu karşılık gelen transkript 2 monositler içine promonocytic, lenfoma kaynaklı, U937 hücrelerinin farklılaşma sırasında birikir. Her iki veri setleri ile tutarlı olarak, genom analizi farklılaştırılmış U937 hücrelerinde RBP2 protein H3K4me3 3 için yüksek derecede zenginleştirilmiş genomik bölgelerde lokalize aldığını gösterdi. Için RBP2 hedeflerine Yerelleştirme H3K4me3 RBP2 histon demethylase aktivite ve transkripsiyonel aktivite azalması nedeniyle bir azalma ile ilişkilidir. Buna karşılık, RBP2 iki diğer doktoralıların H3K4me3 bağlamak mümkün değildir. Özellikle, RBP2 C-terminal etki alanı PHD küçük RBP2 izoform 4 yoktur. H3K4me3 ile etkileşim yoksun RBP2, küçük izoformu genomik yerde büyük izoformu farklıdır düşünülebilir. RBP2 izoformları genomik yerde fark RBP2 fonksiyonunda gözlenen çeşitlilik için hesap. Özellikle, RBP2 retinoblastom protein (pRB) aracılığı ile hücre farklılaşmasında önemli bir oyuncu. 2) bir RBP2 bağlı genler farklılaşma-1) RBP2 farklılaşma bağımsız bir şekilde bağlı genler: izoformları arasında ayrım gözetmeksizin bu veriler, daha önceki genom analizi ile uyumlu olarak, iki ayrı grupta RBP2 hedef genlerin tespit bağımlı bir şekilde. Izoformları arasında yerelleştirme farkları belirlemek için ChIP-Seq genom yer analizi yapıldı. Hepimiz RBP2 hedefleri bulunan iki RBP2 izoformları tespit antikorlar kullanma. Ayrıca biz sadece büyük ve küçük RBP2 izoform (Şekil 4) bağlayan antikorlar var. Büyük izoformu hedefler belirledikten sonra, bir sonra küçük izoformu hedefleri ortaya çıkarmak için tüm RBP2 hedeflerden çıkarabilirsiniz. Bu veriler katkı genomunda bağlayıcı sitelerine protein alımında kromatin-etkileşim etki göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets at JoVE.com

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

genome-wide-analysis-using-chip-to-identify-isoform-specific-gene

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Görüntüleme.  University of Illinois Chicago - UIC. Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.

Video: Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

Çeşitli ChIPseq Veri Türleri Genom çapında Analizi İçin Yeni Bir Bayesian değiştir nokta Algoritması

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of limited use in exploring bacterial two component regulatory systems with uncharacterized activation conditions. Such systems regulate transcription only when activated in the presence of unique signals. Since these signals are often unknown, the in vitro microarray based method described in this video article can be used to determine gene targets and binding sites for response regulators. This DNA-affinity-purified-chip method may be used for any purified regulator in any organism with a sequenced genome. The protocol involves allowing the purified tagged protein to bind to sheared genomic DNA and then affinity purifying the protein-bound DNA, followed by fluorescent labeling of the DNA and hybridization to a custom tiling array. Preceding steps that may be used to optimize the assay for specific regulators are also described. The peaks generated by the array data analysis are used to predict binding site motifs, which are then experimentally validated. The motif predictions can be further used to determine gene targets of orthologous response regulators in closely related species. We demonstrate the applicability of this method by determining the gene targets and binding site motifs and thus predicting the function for a sigma54-dependent response regulator DVU3023 in the environmental bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

This video article describes an in vitro microarray based method to determine the gene targets and binding sites for two component system response regulators.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).