Questo protocollo si traduce in un'estrazione della cromatina riproducibile e affidabile da campioni di fegato congelati per esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina. Per iniziare, posizionare il tubo contenente il tessuto congelato nel mortaio e lasciarlo riposare lì per cinque minuti. Quindi applicare pressione sul campione usando un pestello pre-raffreddato fino a quando non ci sono più sbriciolate solide.
Rimuovere il tubo contenente il campione dalla malta. Aggiungere 950 microlitri di PBS ghiacciato con gli inibitori necessari e pipettare delicatamente su e giù fino a quando il campione non è completamente sospeso. Trasferire immediatamente la sospensione di tessuto all'omogeneizzatore e applicare da 20 a 30 colpi con Pestle A per ottenere una sospensione più fine.
Evitare di spostare il pestello al di fuori della fase liquida per evitare la formazione di schiuma. Trasferire l'omogenato in un nuovo tubo da 1,5 millilitri precedentemente raffreddato su ghiaccio. Quindi centrifugare il tubo per cinque minuti a 1.300 G e quattro gradi Celsius.
Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere completamente il pellet in 950 microlitri di PBS a temperatura ambiente mediante pipettaggio delicato. Quindi aggiungere 63,6 microlitri di formaldeide senza metanolo al 16% per ottenere una concentrazione finale dell'1%Ruotare immediatamente il tubo per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la rotazione, aggiungere 113 microlitri di glicina molare 1,25 a temperatura ambiente per ottenere una concentrazione finale di 125 millimolari e ruotare il tubo per altri cinque minuti.
Quindi centrifugare il campione a 1.300 G per tre minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e risospendere il pellet con attenzione pipettando 950 microlitri di PBS ghiacciato con gli inibitori necessari. Centrifugare nuovamente il campione e risospendere il pellet come dimostrato in precedenza.
Ripetere ancora una volta la fase di centrifugazione e procedere immediatamente alla procedura di isolamento della cromatina. Aggiungere 950 microlitri di tampone A con gli inibitori necessari al pellet e mescolare delicatamente mediante pipettaggio fino a quando il pellet non è completamente sospeso. Quindi ruotare il tubo per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la rotazione, centrifugare il campione a 2.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con attenzione il surnatante. Aggiungere 950 microlitri di Buffer B con gli inibitori necessari al pellet e mescolare delicatamente mediante pipettaggio fino a completa sospensione del pellet. Quindi ruotare il tubo per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo la rotazione, centrifugare nuovamente il campione. Rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere 300 microlitri di tampone C a temperatura ambiente con gli inibitori necessari al pellet e pipettare energicamente.
Vortice il campione per 15-30 secondi. Quindi ruotare brevemente il tubo per raccogliere le gocce sul coperchio. Dopo aver sonicato il campione di cromatina, aggiungere 30 microlitri di soluzione Triton X-100 al 10% e vortice per cinque a 10 secondi.
Centrifugare il campione a 16.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. E trasferire il surnatante in un tubo pulito da 1,5 millilitri pre-raffreddato su ghiaccio. Trasferire da 10 a 25 microlitri di cromatina tranciata in un nuovo tubo e aggiungere il buffer C per raggiungere un volume finale di 200 microlitri.
Aliquote e shock congelano il resto della cromatina a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. Aggiungere otto microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e incubare per almeno sei ore a 65 gradi Celsius nel blocco riscaldante agitando a 1.000 giri / min. Prolungare l'incubazione durante la notte, se possibile.
Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente per cinque minuti, aggiungere due microlitri di RNasi A e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius agitando a 1.000 giri / min. Rimuovere i campioni dal blocco riscaldante e aggiungere sette microlitri di cloruro di calcio 300 millimolare e due microlitri di proteinasi K.Incubare i campioni nel blocco riscaldante a 56 gradi Celsius per 30 minuti agitando a 1.000 giri / min. Nel frattempo, preparare un tubo di separazione di fase per ogni campione centrifugandoli fino a 16.000 G per un minuto a quattro gradi Celsius.
Dopo aver rimosso i tubi dal blocco riscaldante e averli lasciati equilibrare a temperatura ambiente per tre minuti, trasferire 400 microlitri del campione nel tubo a separazione di fase precedentemente centrifugato. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione di alcol isoamilico fenolico cloroformio e vortice per cinque secondi. Centrifugare il tubo a 16.000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi aggiungere 400 microlitri di cloroformio e vortice per cinque secondi. Centrifugare il tubo per altri cinque minuti e trasferire 400 microlitri della fase superiore in un nuovo tubo da 1,5 millilitri che contiene 24 microlitri di cloruro di sodio a cinque molari e 0,75 microlitri di glicogeno. Quindi vortice brevemente il tubo.
Aggiungi 1.055 microlitri di etanolo al 100%. Quindi vortice accuratamente e incubare il campione a meno 80 gradi Celsius per un'ora o a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Al termine dell'incubazione, centrifugare il campione a 16.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con cura il surnatante senza dislocare il pellet.
Aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo al 70% e inclinare delicatamente il tubo per assicurarsi che il pellet venga lavato. Centrifugare il tubo a 16.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con attenzione l'intero surnatante e lasciare asciugare il pellet a temperatura ambiente.
In alternativa, incubare il tubo a 37 gradi Celsius per un'asciugatura più rapida. Aggiungere 50 microlitri di soluzione Tris-EDTA e mettere il tubo sul blocco riscaldante per cinque o 10 minuti agitando a 300 giri / min. Quindi analizzare il DNA su un gel di agarosio all'1%.
Dopo la decross-linking della cromatina e la visualizzazione del DNA sul gel di agarosio, la tosatura di successo può essere riconosciuta dalla presenza di frammenti nell'intervallo da 100 a 300 coppie di basi. La cromatina è stata precipitata con successo con anticorpi trimetilazione H3K4, acetilazione H3K27 e trimetilazione H3 K27 e ulteriormente analizzata mediante qPCR. Il cromosoma uno aperto di lettura 43, la subunità beta due del proteasoma 20S e le regioni promotrici della gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi che sono attivamente trascritte nel fegato hanno mostrato un arricchimento per la trimetilazione H3K4 e l'acetilazione H3K27.
In confronto, homeobox C13, homeobox C12 e le regioni promotorie del fattore di trascrizione della mielina di topo che sono silenziate nel fegato non sono state arricchite come previsto. La trimetilazione H3 K27 mostra il comportamento opposto, confermando così il successo dell'immunoprecipitazione della cromatina o del test ChIP. La cromatina è stata sottoposta con successo a ChIP-Seq.
Dopo il sequenziamento, le canne sono state allineate a un indice precedentemente preparato e separate in base alla specie. Trimetilazione H3K4 e deposizione di acetilazione H3K27 nei siti di partenza della trascrizione genica antagonizzati con la deposizione di trimetilazione di H3K27 come atteso. Il cluster Hox C è noto per essere trascrizionalmente inattivo sia nel fegato di topo che in quello umano.
La profilazione della trimetilazione di H3K4 e dell'acetilazione di H3K27 mostra picchi per queste due modificazioni post-traduzionali al di fuori del cluster, mentre l'intensità del segnale della trimetilazione di H3K27 tende ad aumentare all'interno del cluster genico. L'estrazione della cromatina da campioni di tessuto congelato ha un'elevata variabilità intrinseca, fortemente dipendente dalla finezza della sospensione cellulare e dalla temperatura durante la reticolazione. Garantire condizioni di laboratorio fisse aiuta a mantenere la riproducibilità dell'intervallo di dimensioni dei frammenti.
