Sunulan çalışma FS California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) hibe (RS1-00.477-1) tarafından desteklenmektedir

Çözülme ES hücrelerinin (Video Öne değil) ES hücrelerinin% 10 DMSO içeren ortamda dondurulur. DMSO ES hücrelerinin farklılaşması uyarabilir, bu gün geç hücreleri çözünmesi mümkün olabilir ve böylece artık DMSO etkilerini en aza indirmek için ertesi sabah orta değiştirmek için. <ol><li> 6-iyi bir doku kültürü en az 15 dakika süreyle% 0,1 jelatin ile plaka ve levha hücrelere hemen önce aspire Coat. </li><li> Çözülme ES hücreleri 37 ° C su banyosunda (yaklaşık 5 x 10 6 hücre, bir konfluent 6-iyi eşdeğer) ve prewarmed ES hücre orta içine 10 ml seyreltik. </li><li> Pelet, bir tezgah üstü klinik santrifüj 1000 rpm&#39;de 10 dakika boyunca iplik hücreleri. </li><li> 10 ml 37 ° C prewarmed orta orta ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri aspire edin. </li><li> Transferi hücre 6 plaka süspansiyon ve 37 büyümeye ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör. </li><li> Ertesi gün, ölü hücreler ve artık DMSO kaldırmak için, orta değiştirin. </li></ol> Passage genişlemesi ve ES hücre kültürleri ES hücrelerinin 2 / 3 gün rutin olarak her geçişli, ve orta alternatif gün değiştirilir. Böylece, ES hücreleri günlük dikkat gerektirir. Bizim tecrübelerimize göre, besleyici bağımsız ES hücrelerinin hızla büyümeye ve hızlı bir şekilde sarı dönüm, orta asitlenir. Hücreleri (her gün değişen medya ya da çok düşük bir seyreltme hücreler Pasajlanması) orta asitlenir izin vermek totipotency garanti edilemez sonra, aşırı farklılaşması ve hücre ölümünü tetikler, hücrelerin krizi geçirmesi neden olacaktır. Hücreleri izdiham ulaşmadan büyük öbekler oluşturacak ve bu yığınlara içinde hücreler ayırt veya ölecek gibi çok düşük bir yoğunlukta, geçiş sırasında hücrelerin yetersiz dağılım, ya da düzensiz kaplama Kaplama hücreleri, benzer sorunlara yol açabilir. Germline iletim enjeksiyon zaman sağlıklı görünse bile, kötü muamele edilmiş hücreler önemli ölçüde azaltmıştır. <ol><li> Bir hücre konfluent 6 plaka orta aspirat ve hücrelerin uzak pipetleme, 2-3 ml 37 ° C prewarmed PBS ile yıkayın. </li><li> 1 1 ml × hücreler küçük öbekler halinde eşit dağılmış kadar 3-4 dakika veya tripsin çözüm hücreleri Kapak. </li><li> Tripsin inaktive orta 1 ml ekleyin. </li><li> Taze jelatinize 6 plaka tripsinize hücreleri ve plaka hücreleri (genellikle kuyu 2 / 5) toplayın. </li></ol> Donma ES hücreleri <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi konfluent 6-iyi bir plaka Trypsinize (yaklaşık 1 × 10 7 hücreleri). </li><li> 1000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca orta ve pelet 9 ml tripsinize hücreleri toplayın. </li><li> 1 ml taze hazırlanmış dondurma orta, orta ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire edin. Iki cryotubes içine kısım hücre 0,5 ml. </li><li> Şişeleri Freeze -80 ° C gecelik ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojen transfer. </li></ol> ChIP-on-chip PROSEDÜRÜ Immunoprecipitation <ol><li> Formaldehit crosslinking hücreleri (süspansiyon hücreleri için) <ol><li> Her immunoprecipitation için 1 x 10 8 hücre - 5 x 10 7 kullanın. </li><li> % 1 konsantrasyonda hücre süspansiyonu taze Formaldehit ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika Formaldehit Çözüm hücreleri kuluçkaya. </li><li> Formaldehit gidermek için 1 / 10 hacmi 1,25 M glisin ekleyin. </li><li> 10 ml 1x PBS ile iki kez hücreleri durulayın. </li><li> Havuz, 50 ml konik tüpler hücreler ve 4 5 dakika 700g spin ° C Lizis Buffer 1.5 ml supernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın. 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp hücrelerin aktarın. </li></ol></li><li> Flash-freeze üç kez sıvı nitrojen içinde hücre ve hücreler kırmak için bir doku değirmeni kullanın. Hücreleri çapraz bağlı, onlar -80 ° C süresiz dondurularak saklanmalıdır. </li></ol> (Adımlar 4 ° C yapılır) manyetik boncuk hazırlanması <ol><li> 1,5 ml düşük tutma mikrotüp Dynal boncuk 50 ul ekleyin. Immunoprecipitation her boncuk 1 tüp ayarlayın. 1 ml Blok Çözüm ekleyin. </li><li> Dynal MPC kullanarak boncuk toplayın. Manyetik rafa yerleştirin borular. Boncuklar tüp tarafında toplamasına izin ver. Bu yaklaşık 15 saniye almalıdır Boncuk toplamak için yardımcı olmak üzere iki kez rafa tersine çevirin. Pipet ile süpernatantı. </li><li> Hala yerinde tüpleri ile, raf ve raf tersini manyetik şerit çıkarmadan 1 ml Blok Çözüm ve yavaşça tekrar süspansiyon boncuk boncuk eşit olarak 10-20 kat ya kadar veya tekrar süspansiyon haline getirin. (Adım 2) Yukarıdaki gibi boncuk toplayın. Pipet ile süpernatantı. </li><li> Adım 3, bir kez daha, 1.5 ml Blok Çözüm boncuk yıkayın. </li><li> 750 ul Blok Çözüm boncuk süspanse edin ve 10 mikrogram antikor ekleyin. Rotator, ya da bir gecede, 6 saat, en az 4 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Boncuk üç t yıkayınAdım 3 açıklandığı gibi, 1 ml Blok Çözüm IME&#39;ler. </li></ol> Hücre sonication <ol><li> Sonication için borular ° C ve transfer hücreleri -80 dondurulmuş hücre pelletleri çıkarın. Şu anda sonication için standart bir polupropylene altında, 15 ml konik tüpü kullanmayı tercih. Biz 5 ml işareti de iki adet tüp kesme ve üst yarısında atın. Kurarken Tüpler parafilm veya tüp kap ile karşılanabilir. </li><li> Sonikatör probu üzerinde yaklaşık 0.5-1.0 cm tüp alt oturur mikrofuge&#39;de tüp raf, pozisyon tüp kullanma. Prob merkezli ve tüp kenarlarına temas etmediği dikkat edin. (Probe konumlandırma çözüm köpükler olsun ya da olmasın sonication sırasında etkileyebilir. Tipik olarak, köpük sonicated DNA kötü makaslanmış olacağını gösterir.) </li><li> Süspansiyon 20 sn boyunca 6 kez sonikasyon Örnekleri sonication sırasında bir buz-su banyosunda tutulmalıdır. Başlangıçta 0 olan çıkış gücü, köpük azaltmak ve ilk patlama sırasında nihai güç elle artırmak için. (Köpük önemli varsa, tüm kabarcıklar hiçbir köpük kabarcıkları bırakarak, tüm malzeme yumuşak tabanda takip 20.000 g de santrifüj tarafından kaldırılmış olabilir.) </li><li> Spin 20.000 g de 10 dakika 4 ° C pelet enkaz ve 1.5 ml tüp hasat süpernatantı. </li><li> Giriş DNA gibi her örnekten 50 ul hücre lizat kaydedin. -20 ° C&#39;de muhafaza Sonikasyon lizat toplu başına en az bir giriş DNA kısım tutulmalıdır. Sonication ve parça boyutları ortaya çıkan dağılım etkileri etkileri sadece çapraz ters ve DNA saflaştırılması sonra kontrol edilebilir unutmayın. </li></ol> Kromatin immunoprecipitation <ol><li> Hücre sonication 1 x 10 8 hücre, son hacim 1 ml (Bu manyetik boncuk, Adım 6 hazırlanması 50 ul antikor / manyetik boncuk karışımı 4 adım - 5 x 10 7 kromatin-eşdeğer miktarda ekle Lizis Tampon, hiç) ile ayarlamak mümkündür. 4 rotator gece inkübe ° C </li></ol> Yıkama <ol><li> Dynal MPC kullanarak boncuk toplayın. Raf yerleştirin borular. Boncuklar tüp tarafında toplamasına izin ver. Bu yaklaşık 20 sn olmalıdır Tüm boncuk toplamak yardımcı olmak için iki kez rafa tersine çevirin. Örnekleri arasında değişen ipuçları, pipet ile süpernatantı. </li><li> Her tüpe 1 ml Lizis Tampon ve yavaşça tekrar süspansiyon boncuk ekleyin. 10-20 kat veya boncuk eşit yeniden süspanse kadar - Bu hala yerinde tüpleri ile, raf ve raf tersini manyetik şerit kaldırarak olabilir. Boncuk toplayın. Pipet ile süpernatantı. Yıkar arasında değişen ipuçları, bu yıkama 5 kez daha tekrarlayın. </li><li> Adım 2&#39;de açıklandığı gibi 1 ml IP1 Tampon, boncuk, 6 kez yıkayın. </li><li> Adım 2&#39;de açıklandığı gibi, 1 ml IP2 Tampon boncuk 6 kez yıkayın. </li><li> Adım 2&#39;de açıklandığı gibi 1 ml TE 8.0 Buffer, boncuk, 6 kez yıkayın. </li><li> Spin 960g az 3 dakika 4 ° C ve herhangi bir kalıntı TE Tampon kaldırmak. </li></ol> Elüsyon <ol><li> Tüpler 15 dakika süreyle 65 ° C su banyosunda inkübe boncuk Elüsyon Tampon ve Zehir malzeme 210 ul ekleyin. Kısaca Vorteks her 2 dk. Bu kuluçka eluat kurtarma geliştirmemize yardımcı olabilecek 30 dakika gibi uzun olarak uzatılabilir. </li><li> G oda sıcaklığında 1 dakika 16.000 boncuk aşağı spin. </li><li> 200 ul süpernatant çıkarın ve yeni bir tüpe transfer. Malzeme -20 ° C&#39;de dondurulmuş ve geceleme saklanabilir. </li></ol> Çapraz bağ ters <ol><li> 6 saat ve en fazla 15 saat (daha uzun çapraz ters genellikle mikroarray analizi artan gürültü sonucu) bir en az 65 ° C&#39;de inkübe Elüsyon, Adım 3 immunoprecipitation DNA çapraz Ters . Bu kuluçka tüp eşit olarak ısıtılır ve oluşan az yoğunlaşma yoktur, böylece bir fırında yapılabilir. </li><li> Sonication sonra saklıdır giriş DNA (Adım 13) 50 ul çözülme, 150 ul (3 cilt) elüsyon tampon ve karışımı ekleyin. 65 ° C çapraz bağ ters Adım 1 inkübe edilmesiyle bu giriş DNA çapraz Ters. Bu noktadan itibaren, her tüp immunoprecipitation veya giriş DNA sonraki adımlarda işlem için ayrı bir tüp veya numune olarak kabul edilir. </li></ol> Arıtma DNA <ol><li> 8 ul 10 mg ml-1 RNaseA (0.2 mg ml-1 final konsantrasyon), tersini tüp birkaç kez karıştırın ve 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe </li><li> 20 mg ml-1 proteinaz K (0.2 mg ml-1 final konsantrasyon) ve tersini tüp birkaç kez ve inkübe 55 ° C karışımı 2 saat 4 ul ekle </li><li> Kloroform: 400 ul fenol izoamil alkol (P: C: IA), girdap ve 2 ml Ağır Phaselock tüp (Eppendorf tarafından sağlanan yönergeleri izleyin) ile ayrı fazlar. </li><li> P: C: IA çözüm eski veya düşük pH, degr olacakDNA mikroarray analiz geçerli hedeflerin tespiti ve zarar gürültü neden adation. </li><li> 16 ul 5M NaCl (200 mM) son konsantrasyon) ve 1.5 20 μ ul ul-1 glikojen (30 mikrogram toplam) içeren yeni bir santrifüj tüpüne sulu tabaka transfer </li><li> 800 ul EtOH ekleyin. -80 -20 ° C veya 30 dak ° C gece boyunca inkübe </li><li> 10 dakika 20.000 g Spin 4 ° C pelet DNA. % 80 EtOH 500 ul ekleyerek tekrar süspansiyon pelet vorteks ve 4 az 5 dakika boyunca 20.000 g tekrar iplik ° C pelet yıkayın </li><li> Kalan% 80 EtOH çıkarın. Kalan herhangi bir sıvı toplamak ve pelet kaçınarak, bir pipetteman sıvı kaldırmak için kısaca tüpler dönerler. Tüpler hava pelet sadece kuru hale gelene kadar kurumasını bekleyin: pelet hala nemli bir görünüm saklamalıdır. 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 70 ul her pelletini tekrar. </li><li> Bu pelet saçınızın aşırı onları tekrar süspansiyon zor, ya da tüp yan uzak pul ve soyma sorumlu yapabilirsiniz. </li><li> İsteğe Bağlı: 15 ul immunoprecipitation örnek ileride kullanmak üzere kaydedin. Bu malzeme mikroarray sonuçları gen-spesifik PCR onay gerçekleştirmek için kullanılır. </li><li> (260 nm) UV absorpsiyon konsantrasyonu sayısal olarak. </li></ol> Not: kütüphane hazırlama ve amplifikasyon dNTP olmadan Sigma 10X Amp Mix modifiye GenomePLex WGA kiti kullanmak da dahil olmak üzere aşağıdaki adımları izleyin: Kütüphane hazırlık Sigma 10X Amp Mix GenomePLex WGA kiti mevcuttur. <ol><li> Arıtma DNA, PCR tüp Adım 11 1X Kütüphane Hazırlık Buffer 2 ul DNA örneği 10 ul ekleyin. </li><li> Kütüphane Sabitleme Çözüm 1 ul ekleyin. </li><li> ° C 2 dakika süreyle, santrifüj Vortex iyice pekiştirmek ve 95 termal cycler yer. </li><li> Soğuk, buz üzerinde örnek santrifüj yoluyla santrifüj birleştirmek ve sonra buz dönmek. </li><li> 1 Kütüphane Hazırlık Enzim ul iyice vorteks ve ardından kısa bir süre santrifüj ekleyin. </li><li> Olarak termal cycler ve inkübe Yeri örnek aşağıdaki gibidir: <ul><li> 20 dakika boyunca 16 ° C </li><li> 20 dakika boyunca 24 ° C </li><li> 20 dakika boyunca 37 ° C </li><li> 5 dakika boyunca 75 ° C </li><li> 4 ° C tutun </li></ul></li><li> Termal cycler ve santrifüj kısaca örnekler çıkarın. Örnekler 20 ° C&#39;de üç gün boyunca hemen amplifiye veya saklı olabilir. </li></ol> Amplifikasyon Sigma 10X Amp Mix GenomePLex WGA kiti mevcuttur. <ol><li> Bir master karışımı aşağıda, Adım 3 ila 15 ul reaksiyon için aşağıdaki reaktifler ekleyerek hazırlanır: <ul><li> 10X Amp Mix 7.5 ul (dNTP olmadan) </li><li> WGA DNA Polimeraz 5.0 ul </li><li> 10 mM dNTP (her biri) hisse senedi (son konsantrasyonu 0.4 mM) 3.0 ul </li><li> Nükleaz içermeyen su ile 75 ul son reaksiyon hacmi getir </li></ul></li><li> Iyice Vortex. Kısaca Santrifüj ve thermocycling başlamak. <ul><li> 3 dakika İlk Denatürasyon 95 ° C </li><li> 14 döngüleri aşağıdaki gibi yapın: </li><li> 15 saniye için bozulurak 94 ° C </li><li> 65 uzatın / Tavlama ° C&#39;de 5 dakika </li></ul> Bisiklet tamamlandıktan sonra, 4 reaksiyonlar korumak analiz veya arıtma için hazır olana kadar ° C veya -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Quiagen üreticinin talimatlarına göre, PCR Arıtma ile DNA ® Kit arındırmak ve UV absorpsiyon (260 nm) konsantrasyonu ölçmek. </li><li> Kütüphane Hazırlık amplifikasyon döngüsü tekrar yapın, aşağıdaki adaptasyonlar, Amplifikasyon, Adım 2 Adım 1 ile. • parçalanma sürecini başlatmak için yukarıdaki Adım 3, gerekli DNA miktarı ile ilgili olarak: DNA konsantrasyonu mg / ml, örnek 2.5 ul kullanın ve su ile son hacim 10 ul ayarlamak 200-300 civarındadır. DNA konsantrasyonu 50-60 mg / ml civarında ise, 5 ul örnek ve 10 ul son hacim su ile ayarlamak. • Bu ikinci büyütme işlemi, ana karışımı dTTPs ile dNTP, 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP ve 8 mM dTTP ve aynı konsantrasyonu önceki karışımı az 2 mM dUTP de dahil olmak üzere bir karışımı karşılığında. </li><li> UV-vis spektrofotometre kullanarak ölçün DNA (260 nm). Normalde, daha fazla amplifiye DNA 9 mikrogram Her reaksiyon elde edilir. Not: DNA hedefleri etiketleme GeneChip ile yapılır ® Affymetrix WT Çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kit, üreticinin talimatlarına göre aşağıda açıklandığı gibi: </li></ol> Fragment amplifiye hedefleri <ol><li> Hedefin ne tür bir dizi bağlı olarak uygun aşağıdaki tabloyu kullanarak örnekleri Fragment hibrid olacakiçin randomize. Tablo 1. Tek diziler için Parçalanma Mix <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content"> Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı </td></tr><tr><td class="jove_content"> Çift iplikli DNA 7.5 mikrogram </td></tr><tr><td class="jove_content"> 10X cDNA Parçalanma 4.8 ul </td></tr><tr><td class="jove_content"> UDG, 10 U / ml 1.5 ul </td></tr><tr><td class="jove_content"> APE 1, 100 U / ml 2,25 ul </td></tr><tr><td class="jove_content"> 48 ul Nükleazlar ücretsiz su </td></tr></tbody></table> Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti Tablo 2. Çok dizi setleri için Parçalanma Mix <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı </td></tr><tr><td> Çift iplikli DNA 9 mikrogram </td></tr><tr><td> 10X cDNA Parçalanma 4.8 ul </td></tr><tr><td> UDG, 10 U / ml 1.5 ul </td></tr><tr><td> APE 1, 100 U / ml 2,25 ul </td></tr><tr><td> 48 Nükleazlar ücretsiz su </td></tr></tbody></table> Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti </li><li> Yukarıdaki iki Tablolar göre parçalanma karışımı ayarlayın. Flick-mix ve tüpler aşağı döndürün. </li><li> Inkübe reaksiyonlar: <ul><li> 1 saat boyunca 37 ° C </li><li> 2 dakika süreyle 93 ° C. </li><li> En az 2 dakika süreyle 4 ° C. </li></ul></li><li> Flick-mix, tüpler aşağı spin ve yeni bir tüp 45 ul örnek aktarmak. </li><li> Jel-shift analizi için her numunenin 2 ul çıkarın. </li></ol> Etiket parçalanmış çift iplikli DNA <ol><li> Aşağıdaki tabloda açıklandığı gibi çift iplikli DNA Etiketleme Mix hazırlayın: Tablo 3. Çift iplikli DNA Etiketleme Mix Bileşimi <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen Ses / 1 RXN Miktarı </td></tr><tr><td> 5X TdT Tampon 12 ul </td></tr><tr><td> TdT 2 ul </td></tr><tr><td> DNA Etiketleme Reaktif, 5 mM 1 ul </td></tr><tr><td> Toplam hacmi 15 ul </td></tr></tbody></table> Affymetrix gelen GeneChip ® WT çift iplikli DNA Terminal Etiketleme Kiti </li><li> DNA örnekleri, ti-mix, çift iplikli DNA Etiketleme Mix 15 ul ekleyin ve onları aşağı döndürün. </li><li> Inkübe reaksiyonlar: <ul><li> 37 ° C - 60 dk. </li><li> 10 dakika süreyle 70 ° C. </li><li> 4 ° C en az 2 dk. </li></ul></li><li> Jel-shift analizi için her numunenin 2 ul çıkarın. </li></ol> Gel-shift analizi <ol><li> % 4 agaroz jel hazırlayın. </li><li> Fragment amplifiye hedefler, Adım 5 ve Etiket parçalanmış çift iplikli DNA, 65 Adım 4 ° C &#39;de 2 dakika süreyle örnekler inkübe edin. </li><li> Ul Streptavidin (1 mg / ml), 10 ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe örnekleri ekleyin. </li><li> Etiketleme ürünlerin shift göç kontrol etmek için% 4 agaroz jel Adım 3 (Jel-shift analizi, Adım 1) örnek çalıştırın. </li></ol> Dizi hibridizasyon &amp; Dizi yıkama University of California Riverside Genomik Merkezi tarafından gerçekleştirilir. Dizi analizi Hesaplamalı analiz yapıldı. TAMPON KOMPOZİSYONLAR: Blok Çözüm: PBS +% 0,5 Bovine Serum Albumin (BSA). Lizis Tamponu: 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5 140 mM NaCl 1 mM EDTA % 1 Triton X-100 % 0.1 SDS 1mm PMSF Final pH 7.5 IP1: Lizis Tampon + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mM LiCl 1 mM EDTA % 0.5 &#39;NP-40 % 0.5 Sodyum Dioxycholat Final pH 8.0 TE: 10 mM Tris, pH: 7.4 1 mM EDTA Final pH 8.0 Elüsyon Tampon: TE Tampon +% 1 SDS.

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+complexes+repress+developmental+regulators+in+murine+embryonic+stem+cells.">Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells.</a> Nature. 441, 349-353 (2006).</li><li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+regulators+by+Polycomb+in+human+embryonic+stem+cells.">Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 301-313 (2006).</li><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+the+nucleosome,+fundamental+particle+of+the+eukaryotic+chromosome.">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li><li>Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+Hox-specific+roles+for+the+MLL1+methyltransferase.">Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).</li><li>Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNAs+of+trithorax+response+elements+recruit+Drosophila+Ash1+to+Ultrabithorax.">Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax.</a> Science. 311, 1118-1123 (2006).</li></ol>

Kromatin immunoprecipitation (çip), hücre farklılaşması sırasında kromatin tabanlı işlemler diseksiyon için değerli bir teknik sunmaktadır. Bu yöntemin başarısı için ön koşullar iyi antikor ve antijen ilgi eksikliği kontrol doku veya hücrelerin kromatin durumu. DNA mikroarray teknolojisi, büyük miktarlarda bilgi ChIP birleştirerek elde edilebilir. ChIP sonuçlarının geçerlilik proteinlerin dinamik dernek, protein değişiklikler ve / veya RNA hücre gelişimi sırasında biyolojik süreçlerin yürütülmesi ile bağlantı kurabilirsiniz uygun test sistemlerinin kullanılabilirliğini bağlıdır.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Poteinase-K</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>#EO0491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-A</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fermentas</td>
<td>#EN0531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>formaldehyde 37%</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>FX040-13</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>3150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol </td>
<td>Reagent</td>
<td>Goldshield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15593-031</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SA, fraction V</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>2930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dubecco's Phosphate Buffered Saline</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>5330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S271-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>4050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100 </td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>9410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>J.T Baker</td>
<td>4095-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lithium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>5910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>9230</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NP-40</td>
<td>Reagent</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>492015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deoxycholic acid, sodium salt</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP349-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applichem</td>
<td>631-61-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>4840</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>4840</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dynalbeads, protein A</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100.02D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dynalbeads, protein G</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100.04D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme</td>
<td>Other</td>
<td>Phenix Research Products</td>
<td>MAX-815S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 2.0 ml</td>
<td>Reagent</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>955154037</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation from human embryonic stem cells

Küçük bir kök hücre sayısı, metazoan organizmaların hücre sayısız fonksiyonel ve yapısal karmaşıklığı ortaya çıkar. Kendini yenileme ve hemen hemen her hücre tipi 1 ayırt etmek için bir kök hücre sağlar multipotency: Kök hücreler, iki temel özellikleri ile karakterize edilir . Farklılaşmış hücre ilerlemesini kök hücre faaliyetleri kurmak ve korumak hücre tipine özgü gen ekspresyonu multipotency, yapısal ve morfolojik değişiklikler ve hiyerarşik faaliyet transkripsiyon faktörleri ve sinyal molekülleri kaybı ile karakterizedir. Moleküler düzeyde, hücre farklılaşması, kromatin yapısı ve kompozisyon dinamik değişiklikleri içerir ve bu dinamik değişimler algılama, kök hücre ve hücre farklılaşması süreci 2,3 fonksiyonel özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Kromatin oluşturan yüksek oranda sıkıştırılmış bir DNA-protein kompleksi proteinleri ile hücre paketi, özellikle kromozomal DNA histon 4. Stemcellness ve hücre farklılaşması gibi epigenetik faktörler, histon türevleri ve transkripsiyon faktörleri 2,3,5 gibi düzenleyici proteinlerin belirli dizilerin varlığı ile korele edilmiştir. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) varlığı RNA, proteinler ve kromatin 6,7 protein değişiklikler izlemek için değerli bir yöntem sağlar. Farklı hücre tipleri kromatin karşılaştırma, hücre farklılaşması sırasında meydana gelen protein kromatin dernekler dinamik değişimlere aydınlatmak. Kromatin immunoprecipitation in vivo çapraz bağlı kromatin arıtma içerir. Izole kromatin enzimatik sindirim veya mekanik güç ile daha küçük parçalara azalır. Kromatin parçaları, protein ya da protein ve DNA değişiklikleri hedef spesifik antikorların kullanarak çöktürülür. Çöktürülmüş DNA veya RNA saflaştırılmış ve PCR veya DNA mikroarray tabanlı deneyleri için bir şablon olarak kullanılır. Başarılı bir ChIP için önkoşullar istenen antijen ve hedef molekülü ifade kontrol hücrelerin kromatin durumu yüksek kaliteli antikorlar. ChIP proteinler, protein ve RNA değişiklikler ve özel hedef DNA ile RNA varlığı ilişkilidir ve outread aracının seçimine bağlı olarak, belirli hedef genlerin ya da bütün bir genom bağlamında hedef moleküller arasındaki ilişkiyi algılar. Proteinlerin hücrelerin ayırt kromatin dağılımı karşılaştırma hücrelerinin bir hücre boyunca ilerlemesi ile denk kromatin kompozisyon dinamik değişiklikleri aydınlatmak.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kromatin Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

chromatin-immunoprecipitation-from-human-embryonic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

20.6K Görüntüleme.  University of California - Riverside. ESC farklılaşması, hücre türüne özgü yapısı değişiklikleri ve kromatin bileşimi ile çakışmaktadır. Bu değişikliklerin tespiti stemcellness ve hücre farklılaşması tanımlamak mekanizmaları içine değerli bilgiler sağlar. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kök hücre farklılaşması altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem temsil eder.

Video: Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Biyoloji

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

İnsan Embriyonik Kök Hücre Kültürü ve Bakım

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotipik İnsan Embriyonik Kök Hücreleri kromozom Yayılı Hazırlık

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

İnsan Embriyonik Kök Hücreler Donma ve Çözülme

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...