Uzun süreli depolamadan sonra oosit potansiyelinin canlılığının korunması, genetik seçim programlarının evcil hayvan yetiştiriciliğini geliştireceği, yaban hayatı türlerinin korunması yoluyla biyoçeşitliliğin korunmasına katkıda bulunacağı ve biyoteknoloji araştırmalarını artıracağı için büyük bir fırsat aracını temsil ediyor. Juvenil oosit vitrifikasyonu üreme programlarında nesil aralığında çok daha kısaydı. Ultrarapid soğutma ve ısınma ile vitrifaction sığır oosit korunmasında standart bir yaklaşım olarak kabul edilir.
Bununla birlikte, koyunlarda bu prosedür hala nispeten yeni olarak kabul edilir ve standart bir yöntem eksiktir. Bu videoda, hem genç hem de yetişkin donörlerden toplanan ve in vitro kriyoprezervasyondan önce olgunlaşan koyun oositinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, in vitro olgunlaşma, vitrifikasyon, ısınma ve ısınma sonrası kültürden tüm prosedürleri içerir.
Kümülüs oosit kompleksini geri aldıktan sonra, 24 saat boyunca in vitro olarak olgunlaştırılarak, olgunlaşma ortamında yüz mikromolar trehaloz ile takviye, juvenil oosit için dahil bir durum. İn vitro olgunlaşmayı takiben, oositler Kümülüs hücrelerinin hafifçe pipetlenmesiyle mekanik olarak inküre edildi ve stereo mikroskop altında 60x büyütme ile incelendi. Vitrifikasyon prosedürlerinde sunacak oositlerin seçimi, bu prosedürün başarılı bir şekilde uygulanmasını garanti etmek için ilk önemli adımı temsil eder.
Sadece tek tip sitoplazma olanlar, lipit damlacıklarının homojen dağılımı, uzayda tüm Emma geniş ve sürekli pivotal bütünlüğü, kompakt zona pellucida yaklaşık 19 mikrometre dış çapı ve ilk kutup gövdesinin ekstrüzyonunu gösteren ve böylece M2'de aşama seçilmelidir. Vitrifikasyon, bir Cryotops cihazı ile minimum temel hacim yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Seçimden sonra, beş çocuk oosit grubu iki dakika boyunca taban ortamında 38,5 santigrat derecede koşullandırılmıştır.
Oositler daha sonra bir kalibrasyon çözeltisine üç dakika maruz kalıtsal maruz kalıtsal olarak susuz kaldı. Oositlerin kullanılan vitrifikasyon cihazına yüklenmesi önemli ve kritik bir adımdır. Kriyotop, tutucuya bağlı bir polipropilen şerit kullanır.
Bu yöntemde, vitrifikasyon çözeltisinde, 0 puan mililitreden daha az olan oositler, film şeridinin üzerine hızla cam bir kılcal damar ile yüklenir. Daha sonra çözelti çıkarılmalı ve geride kriyoprezerserve edilecek hücreleri kaplayacak kadar ince bir tabaka bırakılmalıdır. Cryotop cihazına yüklenmeden ve 30 saniye içinde doğrudan sıvı nitrojene dalmadan önce.
Sıcak iç biyolojik sıcaklık için, her vitrifikasyon cihazının içeriği sıvı azottan azalan trehaloz çözeltisinin 200 mikroliter damlasına aktarıldı. Oositler, intracelular kriyoprotektantların çıkarılmasını teşvik etmek için oositleri ince, cam pipetle sürükleyerek aktarıldı. Son olarak, oositler% 5 karbondioksitte inkübatörde bir baz ortamda önceden yetiştirildi.
Isınmadan hemen sonra ve ısınma sonrası kültürün her zaman noktası için, oositler 100x büyütmeli ters bir mikroskop kullanılarak morfolojik olarak değerlendirildi. Çocuk donörlerden gelen oositlerin kriyo toleransı, ısındıktan sonra daha düşük membran bütünlüğüne sahip değiştirilmiş olanlara kıyasla daha düşüktür. Juvenil oositlerde indüklenen olgunlaşma ortamında trehaloz kullanımı daha yüksek membran bütünlüğünü artırarak vitrifikasyon sonrası sağkalım oranlarını artırır.
Ancak trehaloz takviyesi ile rekolte, döllenme ve juvenil oositlerin gelişim oranları artmamıştır. Juvenil oositlerin vitrifikasyonu için 2,2 miligram desilitreye eşit kalsiyum konsantrasyonuna sahip ortamların kullanımı, kalsiyum konsantrasyonu ile vitrifiye edilen oositlere kıyasla daha yüksek döllenme oranlarına sahip olmalıdır, ancak üretimi sağlayan herhangi bir farklılık bulunamadı. Isınma sonrası kültürü farklı sürelerde karşılaştırarak, yaşlı iki kişiden toplanan dört saatlik kültür oositinden sonra enerjik bağları ve mikrotübüler kurulumu geri kazanabildiğini ve daha yüksek dekolte ve blastosit atıkları ile gelişimsel yetkinliği geri kazanabildiğini gösterdik.
Mitokondriyal aktivite, dört saatlik ısınma sonrası kültürden sonra diğer zaman noktalarına kıyasla vitrifiye sıcak juvenil oositlerde daha yüksekti. Mitokondriyal dağılım ayrışması da altı saatlik ısınma sonrası kültür sırasında değişti. Ayrıca, reaktif oksijen türleri hücre içi düzeyleri, ıslah edici oositlerde ısınma sonrası kültürün iki saatinde 0, 4 ve 6 saate kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü.
Bununla birlikte, diğer oositlerde bulunanların aksine, juvenil oositlerde ısınma sonrası kültür sırasında spontan partenogentik aktivasyon oranları artmıştır. Önerilen yöntemin ana avantajlarından biri, oosit toplanmasından in-vitro olgunlaşmaya, vitrifikasyona ve ısınmaya kadar tüm adımları içermesidir. Ayrıca, vitrifikasyon prosedürü sırasında oluşan hasarlardan oosit iyileşmesine izin vermek için ısınma sonrası bir kültür dönemi içerir.
Döllenme için en uygun zamanı seçmek zordur ve vitrifikasyon programının sonucunu etkileyebilir. Yavaş dondurmanın aksine, vitrifikasyonun manuel bir teknik olduğu ve bu nedenle operatöre bağlı olduğu da düşünülmelidir. Bu nedenle, vitrifikasyon programının sonucunun değerlendirilmesinde operatör etkisini dikkate alan yetenekli teknisyenlere ve araştırmacılara duyulan ihtiyaç büyük bir zorluktur.
Laboratuvarımızdan daha fazla çalışma, oosit vitrifikasyon prosedürünü ve seçimini standartlaştırmaya ve medya kompozisyonunu juvenil oosit ihtiyaçlarına daha iyi uyarlamaya izin verecektir. Kültür ve karakter kullanımı ve antioksidan kullanımı hakkında bir ihmal umut verici fırsatlar sunuyoruz.
