長期保存後の卵母細胞の生存可能性の維持は、遺伝的選択プログラムによる家畜飼育の改善、野生生物種の保全を通じた生物多様性の保全、バイオテクノロジーの研究の増加に寄与するため、大きな機会のツールを表しています。若年卵母細胞ガラス化は、繁殖プログラムにおける生成間隔においてはるかに短かった。超急速な冷却および温暖化によるビトリファクションは、牛の卵母細胞保存における標準的なアプローチと考えられている。
しかし、羊では、この手順はまだ比較的新しいと考えられており、標準的な方法が欠けています。このビデオでは、若年性および成人ドナーの両方から採取された羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルと、凍結保存前に成熟した体外でのプロトコルについて説明します。このプロトコルには、体外成熟、ガラス化、温暖化、温暖化後の培養からのすべての手順が含まれます。
乳母卵複合体を回収した後、若年卵母細胞を含む状態で24時間インビトロで成熟し、成熟培地におけるトレハロースの百マイクロモルによる補充。体外成熟後、卵母細胞はCumulus細胞を穏やかにピペット化して機械的に脱ヌードし、60倍の倍率でステレオ顕微鏡で検査した。ガラス化手順で提出する卵母細胞の選択は、この手順の正常な適用を保証する最初の重要なステップを表します。
均一な細胞質を有する者だけが、脂質滴の均質な分布を有し、すべてのエマ広く、そして空間における連続的な極めて重要な完全性、コンパクトなゾナ透明体は約19マイクロメートルの外径を示し、したがって、第1極体の押出を示し、したがってM2では、段階を選択しなければならない。ガラス化は、クライオトップス装置を用いて、最小必須ボリューム法を用いて行った。選択後、5つの若い卵母細胞のグループを2分間、ベース培地で38.5°Cに条件付けした。
次いで、卵母細胞を、キャリブレーション溶液に3分間曝露して脱水した。使用されるガラス化装置における卵母細胞のローディングは重要かつ重要なステップである。クライオトップはホルダーに付すポリプロピレンストリップを使用します。
この方法では、ガラス化溶液中の卵母細胞は、0ポイント未満のミリリットルが、フィルムストリップの上にガラスキャピラリーを急速に装填する。その後、溶液を除去し、凍結保存される細胞を覆うのに十分な薄い層を残す必要があります。クライオトップ装置にロードされる前に、30秒以内に液体窒素に直接突っ込んだ。
温かい内部の生物学的温度については、各ガラス化装置の含有量を液体窒素から200マイクロリットルの減少トレハロース溶液に移した。卵母細胞を移管したセットは、卵母細胞を薄いガラスピペットで引きずり、眼下凍結保護剤の除去を促進した。最後に、卵母細胞を5%の二酸化炭素中のインキュベーター中の塩基培地で前繁殖した。
温暖化直後、および温暖化後培養の各時点について、卵母細胞を100倍倍の逆顕微鏡を用いて形態学的に評価した。若年性ドナーからの卵母細胞のクライオ耐性は、温暖化後の膜完全性が低い変化したものに比べて低い。若年卵母細胞でより高い膜完全性で誘導される成熟培地におけるトレハロースの使用は、ガラス化後の生存率を増加させる。
しかし、切断、受精、および若年卵母細胞の発達率はトレハロース補充によって増加しなかった。若い卵母細胞のガラス化のために2.2ミリグラムのデシリットルに等しいカルシウム濃度の培地を使用すると、カルシウム濃度でガラス化された卵母細胞と比較して受精率が高いが、生産を可能にする違いは見つからなかった。温暖化後の培養を異なる期間で比較することにより、古い2つから採取された4時間の培養卵母細胞が、エネルギッシュな結合と微小管のセットアップを回復し、より高い切断および芽細胞廃棄物で発達能力を回復できることを示した。
ミトコンドリア活性は、他の時点と比較して、温暖化後培養の4時間後にガラス化された暖かい若年卵子において高かった。ミトコンドリア分布の分け替えも、温暖化後の培養の6時間の間に変化した。さらに、細胞内活性酸素種は、0、4、および6時間と比較して、温暖化後培養の2時間で若年卵母細胞において有意に低かった。
しかし、他の卵母細胞に見られるものとは対照的に、若年卵母細胞における温暖化後培養中に自発的なパルテノゲン化活性化の割合が増加した。提案された方法の主な利点の1つは、卵母細胞の収集から体外成熟、ガラス化、および温暖化に全てのステップが含まれていることである。さらに、ガラス化手順中に発生した損傷からの卵母細胞回収を可能にする温暖化後培養期間が含まれています。
受精に最適な時間を選択することは困難であり、ガラス化プログラムの結果に影響を与える可能性があります。また、遅い凍結とは異なり、ガラス化は手作業の手法であり、オペレータに依存する点も考慮する必要があります。そのため、ガラス化プログラムの結果評価においてオペレータの効果を考慮した熟練技術者や研究者の必要性が大きな課題です。
私たちの研究室からのさらなる研究は、卵母細胞ガラス化手順と選択を標準化し、若い卵母細胞のニーズに合わせてメディア組成物をより良く調整することを可能にします。文化と性格と抗酸化物質の使用に関する無視は、私たちは有望な機会を提供します。
