El mantenimiento de la viabilidad potencial de los ovocitos después del almacenamiento a largo plazo representa una herramienta de gran oportunidad, ya que mejoraría la cría de animales domésticos mediante programas de selección genética, contribuiría a preservar la biodiversidad a través de la conservación de especies silvestres y aumentaría la investigación en biotecnología. La vitrificación de ovocitos juveniles fue mucho más corta en el intervalo de generación en los programas de cría. La vitrifacción por enfriamiento y calentamiento ultrarápido se considera un enfoque estándar en la preservación de ovocitos de ganado.
Sin embargo, en el ganado ovino este procedimiento todavía se considera relativamente nuevo y falta un método estándar. En este vídeo, describimos un protocolo para la vitrificación de ovocitos de ovejas, recogidos de donantes juveniles y adultos, y madurado in vitro a antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos de maduración in vitro, vitrificación, calentamiento y cultivo post-calentamiento.
Tras recuperar el complejo ovocitos Cumulus, donde se maduró in vitro durante 24 horas en estática una condición que incluye para ovocitos juveniles, la suplementación con cien micromolares de trehalosa en medio de maduración. Después de la maduración in vitro, los ovocitos fueron denudados de las células cumulus mecánicamente pipeteando suavemente y examinados bajo microscopio estéreo, con la ampliación de 60x. La selección de los ovocitos a someter en los procedimientos de vitrificación representan el primer paso importante para garantizar la aplicación exitosa de este procedimiento.
Sólo aquellos con el citoplasma uniforme, con distribución homogénea de gotitas lipídicas, integridad de todo Emma amplio y continuo pivotal en el espacio, zona compacta pelúcida el diámetro exterior de unos 19 micrómetros y mostrando la extrusión del primer cuerpo polar, y por lo tanto en el M2, etapa deben ser seleccionados. La vitrificación se realizó utilizando el método de volumen mínimo esencial, con un dispositivo Cryotops. Después de la selección, un grupo de cinco ovocitos juveniles fueron condicionados a 38,5 grados centígrados en medio base durante dos minutos.
Los ovocitos fueron entonces deshidratados por la exposición de tres minutos a una solución de la calibración. La carga del ovocito en el dispositivo de vitrificación utilizado es un paso importante y crítico. Cryotop utiliza una tira de polipropileno unida a un soporte.
En este método, los ovocitos en la solución de vitrificación, menos de 0 punto mililitro se cargan rápidamente con un capilar de vidrio en la parte superior de la tira de película. Luego se debe eliminar la solución, dejando atrás una capa lo suficientemente delgada como para cubrir las células que se van a criopreservar. Antes de ser cargado en el dispositivo Cryotop y sumergido directamente en nitrógeno líquido dentro de 30 segundos.
Para una temperatura biológica interior cálida, el contenido de cada dispositivo de vitrificación se transfirió de nitrógeno líquido a 200 gotas de microlitro de solución de trehalosa decreciente. Los ovocitos se transfirieron al conjunto, arrastrando los ovocitos con una pipeta fina y de vidrio, para promover la eliminación de los crioprotectores intracelulares. Finalmente, los ovocitos fueron pre-criados en un medio base en incubadora en dióxido de carbono al 5%.
Inmediatamente después del calentamiento, y para cada punto de tiempo de la cultura post-calentamiento, los ovocitos fueron evaluados morfológicamente usando un microscopio invertido con aumento de 100x. La tolerancia al crio de los ovocitos de donantes juveniles es menor en comparación con los alterados con menor integridad de la membrana después del calentamiento. El uso de trehalosa en medio de maduración indujo en ovocitos juveniles una mayor integridad de la membrana, aumentando las tasas de supervivencia después de la vitrificación.
Sin embargo la hendidura, la fertilización, y los índices de desarrollo de ovocitos juveniles no fueron aumentados por la suplementación de la trehalosa. El uso de medios con concentración de calcio igual a 2,2 miligramos decilitro para la vitrificación de ovocitos juveniles, debería tener mayores tasas de fecundación en comparación con los ovocitos vitrificados con concentración de calcio, pero no se encontraron diferencias que permitieran la producción. Mediante la comparación de la cultura post-calentamiento en diferentes duraciones, se demostró que después de cuatro horas de cultivo de ovocitos recogidos de los dos mayores son capaces de recuperar los enlaces energéticos y la configuración microtubular, y para restaurar la competencia de desarrollo con mayor escisión y blastocitos residuos.
La actividad mitocondrial era más alta en ovocitos juveniles calientes vitrificados después de cuatro horas de cultura del poste-calentamiento, comparada a otros puntos del tiempo. La distribución mitocondrial de la separación también cambió durante seis horas de cultura del poste que calentaba. Por otra parte, los niveles intracelulares reactivos de la especie del oxígeno eran perceptiblemente más bajos en ovocitos juveniles en dos horas de cultura de poste-calentamiento comparadas a 0, 4, y 6 horas.
Sin embargo, y en contraste con lo encontrado en otros ovocitos, las tasas de activación partenogenética espontánea aumentaron durante el cultivo post-calentamiento en ovocitos juveniles. Una de las principales ventajas del método propuesto es que incluye todos los pasos desde la recolección de ovocitos hasta la maduración in vitro, la vitrificación y el calentamiento. Además, incluye un período de cultivo post-calentamiento para permitir la recuperación de ovocitos de los daños incurridos durante el procedimiento de vitrificación.
Elegir el momento óptimo para la fertilización es un desafío, y puede afectar el resultado del programa de vitrificación. También debe considerarse que, a diferencia de la congelación lenta, la vitrificación es una técnica manual y, por lo tanto, depende del operador. Por esta razón, un desafío importante es la necesidad de técnicos e investigadores calificados que tengan en cuenta el efecto del operador en la evaluación del resultado del programa de vitrificación.
Otros estudios de nuestro laboratorio permitirán en el intento de estandarizar el procedimiento de vitrificación de ovocitos y la selección, y en una mejor adaptación de la composición de los medios a las necesidades del ovocito juvenil. Un desprecio sobre el uso de la cultura y el carácter y antioxidante que ofrecemos oportunidades prometedoras.
