Metastaz kansere bağlı ölümlerin önde gelen bir nedenidir. Bu fenomen, kanser hücreleri birincil tümörden ayrılır, sonunda uzak bir hedef organa ulaşmak için kan dolaşımına girdiğinde ortaya çıkar. Bu müstakil hücreler kana girdikten sonra sekonder tümör hücreleri diyoruz.
Değişken bir materyali temsil ederler, çünkü bir yandan metastaz oluşumunun ana suçlusudurlar, diğer yandan tümör biyopsilerinden daha kolaydırlar. Aslında, basit bir kan delinmesi ile toplanabilirler. Kan örneğindeki bu hücrelerin sayısının düşüklüğüne rağmen, 3D kontrollü durumu kullanarak hastanın kanından daha fazla endişeyle dolaşan birkaç tümör hücre hattı kuran ilk kişiyiz.
Bu hücre hattı, rutin deneyler için herhangi bir ticari hücre hattında kullanılabilir. Örneğin, genetik ilaç taraması için, ilgi çekici proteine, aynı zamanda tümörün başlangıç kapasitesini ve metastatik potansiyellerini test etmek için in vivo deney için. Dolaşımdaki tümör hücre hatları olan CTC, hipokside 3D koşullarda kültürlenmelidir.
CTC küreler oluşturduktan sonra, onu ortama koyabilir ve 300 RCF'de beş dakika santrifüj edebiliriz. Süpernatantı atın ve 500 mikrolitre Accumax ekleyin. Birini askıya alıyoruz ve çözeltiyi 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırıyoruz.
Daha sonra ayrışmış küreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri peletin. Peletin yeni desteklenmiş bir DMEM/F12 ile yeniden kullanın ve yeni bir 24 Düşük Bağlantı plakasında mikroliter başına beş hücre yoğunluğundaki hücreleri görün. Santrifüj CTC küreleri süpernatantı ortadan kaldırır ve peleti PBS ile iki kez yıkar.
500 mikroliter PFE'de iyice karıştırın ve tüpü 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra, sabit küreleri santrifüjleyin ve peleti PBS ile iki kez yıkayın, maksimum PBS hacmini ortadan kaldırır ve 20 mikroliter oluşturan HistoGel ekleyin. Süspansiyona alın ve kültür vazosuna bir damlacık yapın, 10 dakika kurumaya bırakın ve neşter kullanarak ayırın.
Artık istediğiniz bir ilgi proteinini hedefleyen CTC'lere istediğiniz herhangi bir işlem yapabilirsiniz. CPC'leri toplayın ve daha önce açıklandığı gibi küreleri Accumax ile ilişkilendirin. Accumax'ı ortadan kaldırın ve peleti üç mL bloklama tamponu ile yeniden kullanın ve süspansiyonu tek hücreli çözelti elde etmek için 14 mikrometre hücre süzgecinden geçirin.
Hücreleri sayın ve tüplere sevk edin ve 200.000 hücrelik bir hacim ekleyin, tüpleri santrifüjleyin ve üstnatantı atın. Antikor veri sayfasına göre, bir tüpe, antikorun istenen hacmini ve başka bir tüpe izotipini ekleyin ve üreticinin rehberliğini takip eden adımlara devam edin. Kalan tüp etiketlenmeyecaktır ve bu deneyde bir canlılık pazarının kullanılması şiddetle önerilmiştir.
Sitometrede, negatif etiketli alandaki voltajı ayarlamak için etiketlenmemiş tüple başlayın. Bunu takiben, izotip tüpünü yerleştirin. İzotip, pozitif sinyal ile spesifik olmayan sinyali ayırt etmek için negatif bir kontrol görevi alacaktır.
Ve eğer ilgi proteini ifade edilirse, pozitif etiketli kapıda bir kayma görmeniz gereken ilgi antikoru ile etiketli hücrelerle yapılan deneyi bitirin. Bu, mL başına 200.000 hücre yoğunluğunda takviyeli ortamda ayrışmış CTC'leri askıya 1.800'e kadar askıya 100.000 hücredir. Ultra Düşük ataşman 96'da, kuyu plakası, 50 mikroliter hacmini kapatın ve plakayı hipokside 24 saat kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, test edilen ilacın 50 mikroliter farklı konsantrasyonu ekleyin ve aynı hacimde DMEM / F12 ekleyin, sadece hücresel canlılık tabanını daha fazla belirlemek ve plakayı 48 saat daha kuluçkaya yatırmak için. Üçüncü günde, ajanı yeniden inşa edin ve her kuyuya 70 mikroliter karışım ekleyin. Plakayı 20 dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya koyun ve ardından lüminesansı ölçün.
Bu tahlil, CTC'nin hücre büyümesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için çok sayıda ilacı test etmek için yararlı bir araçtır. Eppendorf'ta, 100 mikroliter PBS'deki hücreleri yeniden kullanın, cildi farenin arkasına sıkıştırın ve iğneyi derinin altına yerleştirin. Tüm hacmi aynı noktaya yavaşça enjekte edin ve her iki günde bir tümör büyümesini izleyin ve tümör 1,5 santimetreküp boyutunu aştıysa fareleri feda etti.
Ameliyattan önce, farenin dorsal ventral tarafına deri altı bir ağrı kesici enjekte edin, 10. Dalağını yavaşça kaldırın ve steril bir gazlı bez üzerine yatırın. Bir insülin şırıngası kullanarak, PBS'ye 50 mikroliter resüspended CTC enjekte edin ve iğneyi çıkarmadan üç dakika bekleyin.
Arteriyel damarı bir taraftan, venal damarı diğer taraftan ligatlayın. Daha sonra iki ligatürün hemen üzerinde keserek dalağını çıkarın. Karın peritonum ve cildi dikin ve bölgeyi iyice dezenfekte edin.
Bu deneyin amacı kolorektal kanser hastasından elde edilen CTC'lerin karaciğeri kolonize etme kapasitesini, görünür metastatik öngörüye indüklenerek test etmektir. Klinik tümör hücre hattının izole edilmesi ve kurulması hem temel hem de çevirisel çalışmalar için acil bir araçtır. Örneğin, in vivo çalışmaların bu genin kolorektal kanser hücre hatlarının göç ve istila kapasitesinde yer aldığını gösterdiği ilgi çekici bir geniniz varsa, farelerin dalağına enjeksiyondan önce dolaşımdaki tümör hücre hatlarında bu geni nakavt etmek, karaciğeri kolonileştirmelerine izin vermek vivo sonucunuzu doğrulamak için iyi bir araç olabilir.
Çeviri çalışmaları için dolaşımdaki tümör hücre çizgilerini izole etme konusundaki ana bakış açımız bu değerli materyali kişiselleştirilmiş tıpta kullanmaktır. Hastanın kan örneklerinden, mevcut ilaç panelini taramak ve sitotoksikliğini değerlendirmek için yeterli malzemeye sahip olmak için iki veya üç hafta boyunca kültürdeki CTC'leri izole eder ve güçlendirirdik.
