Protokolümüz önemlidir, çünkü birincil kanser hücrelerinden bir nesil 3D tümör kültürü modelini tanımlar ve bu model gerçek dünyadaki tümör biyolojisini hücre hatlarından daha iyi temsil eder. Bu yaklaşım çeşitli solid tümörlere uygulanabilir. Ayrıca, tipik bir hücre biyolojisi laboratuvarında baştan sona gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir.
Bu yaklaşım kullanılarak üretilen 3D tümör modelleri, tümörlerin anti-kanser tedavilerine veya tedavilerin bir kombinasyonuna duyarlılığı ve direnci üzerine yapılan araştırmaları desteklemektedir. Bu yaklaşım, birincil kanser hücrelerinden 3D modeller üretir. Bu nedenle, belirli bir hasta için hangi tedavinin etkili olabileceğini belirleyebilir ve böylece tedavisini kişiselleştirmeye yardımcı olabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Ella Itzhaki olacak. Başlamak için, tek hücreli yapışkan birincil hücre kültürüne sahip küçük bir T25 şişesi alın ve hücre kültürü ortamını çıkarın. Hücreleri PBS ile yıkayın ve% 75 ila% 100 birleşimli yapışkan primer tümör hücre kültürlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için 37 santigrat derecede üç dakika boyunca bir mililitre 1x Accutase ekleyin.
Beş mililitre hücre kültürü ortamı ekleyerek Accutase çözeltisini nötralize edin. Hücreleri 10 mililitrelik bir serolojik pipetle aspire edin ve 15 mililitrelik bir konik tüpte biriktirin. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800g'de santrifüjleyin.
Hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre peletinin üzerine sekiz mililitre taze hücre kültürü ortamı ekleyin, ardından yavaşça karıştırın. Canlı hücreleri bir hemositometre ile saymak için, hücre süspansiyonunun 50 mikrolitrelik bir alikotunu alın ve 50 mikrolitre tripan mavisi ile karıştırın. Ardından canlı hücreleri sayın ve süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısını hesaplayın.
Ardından, 3B kültür ortamını hazırlayın. Tahlil için gereken hücre sayısını ve gereken toplam hacmi hesapladıktan sonra, 3D kültür ortamının 200 mikrolitresinde istenen sayıda hücre ile hücre süspansiyonunu hazırlayın. Homojen bir dağılım sağlamak için pipetle nazikçe karıştırın.
Süspansiyonu bir pipetleme haznesine aktarın ve çok kanallı pipetli ultra düşük bağlantı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin kümelenmesini zorlamak için plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300g'de santrifüj edin, böylece hücre agregasyonunu iyileştirin ve plakayı% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'da tekrar santrifüj yaptıktan sonra, ortamın %50'sini nazikçe çıkarın ve atın ve mevcut çözeltiyi değiştirmek için 100 mikrolitre taze 3D kültür ortamı ekleyin.
Bu adımı tekrarlayın ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin. Sferoid oluşumu izlemek için hücreleri her bir ila iki günde bir mikroskop altında inceleyin. Görüntüleme yazılımındaki ölçek aracı kullanılarak oluşturulan sferoidlerin çapını ölçün.
Küresel çap 100 ila 200 mikrometreye ulaştığında, ilaç etkinliği deneylerini gerçekleştirin. Küre toplama için, her bir kuyucuktan küreleri toplamak için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve bunları 15 mililitrelik bir konik tüpe koyun. Konik tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g'da santrifüj edin ve bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.
Hücre kültürü ortamının 0.5 mililitresini ekleyin ve peleti iyi ama nazikçe askıya alın. Küresel sayım yapmak için, 96 delikli bir plaka kullanın ve kuyuyu kadranlara bölmek için kuyunun alt tarafına bir artı işareti çizin. Kuyuya 50 mikrolitre süspansiyon ekleyin.
Ve 10x objektif lensle, sferoidleri mikroskop altında manuel olarak sayın. Her kadrandaki sferoidleri sayın ve kuyudaki toplam sferoid sayısını hesaplayın. Ardından, hacmi sayarak küresel sayıyı iki katına çıkararak küresel konsantrasyonu hesaplayın ve süspansiyondaki toplam sferoid sayısını hesaplayın.
Yeni bir tüpte, 200 mikrolitre hücre kültürü ortamı başına 200 sferoid konsantrasyonunda sferoid süspansiyon hazırlayın. Her ilaç tedavisi için, sferoid stoğunu farklı bir tüpte hazırlayın. Her ilaç için gereken toplam miktarı, tekrarlar için gereken kuyucuk sayısına göre hesaplayın ve ilacı tüpe gereken son konsantrasyona ekleyin.
Küresel süspansiyonun 200 mikrolitresini ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarın ve plakayı% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Sferoidleri çalışma ilacı ile 24 ila 72 saat boyunca inkübe ettikten sonra, plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300g'de santrifüj edin ve hücre kültürü ortamının 170 mikrolitresini yavaşça çıkarın ve kuyunun dibinde 30 mikrolitre bırakın. MTT çözeltisini hazırlayın ve her bir kuyucuğa 70 mikrolitre çözelti ekleyin ve kuyu başına 100 mikrolitrelik son bir hacme getirin.
Kuyudaki son MTT konsantrasyonu, 100 mikrolitre başına 0.05 miligram olacaktır. Ek olarak, hücresiz MTT çözeltisi ile boş kuyucuklar hazırlayın. Kuyucuklardaki çözeltinin renginde bir değişiklik gözlenene kadar% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bir değişiklik gözlendiğinde, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre Stop çözeltisi ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan kuyucukların içeriğini hafifçe karıştırın. Plakanın absorbansını 570 nanometre dalga boyunda ve 630 ila 690 nanometre arka plan dalga boyunda bir parametre ELISA okuyucusunda okuyun. Hücre canlılığını hesaplamak için, her bir kuyucuk için spesifik sinyali hesaplayın.
Ardından boş kuyucukların ortalama değerini hesaplayın ve bu değeri her kuyudan çıkarın. Çalışma ilacı ile tedavi edilmeyen hücreleri içeren kontrol kuyularındaki spesifik sinyallerin ortalamasını hesaplayın. Son olarak, her bir kuyucuktaki hücrelerin, işlenmemiş hücrelere sahip kuyucuklara göre yaşayabilirliğini hesaplayın.
Birincil kolon kanseri hücre kültüründen zamanla başlangıçta tohumlanan hücrelerin sayısı ile sferoidlerin oluşumu burada gösterilmiştir. Bu şekilden, üretilen sferoidlerin sayısının, başlangıçta her bir kuyucukta tohumlanan hücrelerin sayısına bağlı olduğu görülebilir. Kültürde 10 gün sonra birincil kolon kanseri hücrelerinden gelen sferoidler, kuyu başına 2.000 ilk hücre tohumlaması ile burada gösterilmiştir.
Kolon kanseri sferoidlerinin uzun süreli kültürü üzerine, birbirlerine yapışmaya başladılar ve homojen bir kültürü önleyen ve böylece MTT tahlillerinde sferoidlerin kullanımını yasaklayan sferoidler ve üzüm benzeri yapılar kümeleri oluşturdular. Palbociclib, sunitinib ve bunların kombinasyonlarının kolon ve meme kanseri de dahil olmak üzere primer tümör hücrelerinden sferoidler üzerindeki etkileri burada gösterilmiştir. Kolon ve meme kanseri hücrelerinden türetilen sferoidler üzerinde bir MTT testi yapıldı.
MTT sinyalleri, DMSO ile tedavi edilen hücrelerden gelen değerlere normalleştirildi. Değerler, dört ila sekiz çoğaltma arasındaki araçları temsil eder. Çeşitli tedavilerin hücre büyümesi üzerindeki etkileri de sıfır günde ve kolon kanseri ve meme kanseri hücrelerinden türetilen sferoidlerin üç günlük tedavisinden sonra mikroskobik olarak değerlendirildi.
Trastuzumab artı vinorelbin ve 5 florourasil artı sisplatinin zamanla meme kanserinden türeyen sferoidler üzerindeki etkileri bu şekilde sunulmuştur. Sferoidlerin çapının tedavi süresine göre sıfır gününe göre değişimi burada gösterilmiştir. Her tedavi grubu, her bir kuyucukta bir küre bulunan dört ila altı kuyu içeriyordu.
Ortalama değişim burada sunulmaktadır. Sferoidler, anti-kanser tedavisine yanıtın ötesinde birçok çalışma için önemli araçlardır. Bu çalışmalar, örneğin, ilaç dağıtımını ve hatta hücre-hücre etkileşimleri gibi temel biyoloji sorularını ele almaktadır.
Tek hücreli bir süspansiyonla küresel üretim sürecini başlatmak çok önemlidir. Ayrıca,% 5 bazik membran metrikleri içeren bir ortama sahip ultra düşük bağlantı plakalarının kullanılması da kritik öneme sahiptir.
