HPSC'lerden retina hücrelerine kadar indüksiyon süreci karmaşık ve zaman alıcıdır. Bu optimize edilmiş protokol, yüksek tekrarlanabilirlik ve maliyet olmadan retina dokuları üretebilir. Bu protokolün avantajı, hPSC'lerden retina indüksiyonunun verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırmak için EB boyutunun ve kaplama yoğunluğunun ölçülmesidir.
Bu yöntemle, tüm ana retina hücreleri ardışık olarak ortaya çıkar ve retina gelişiminin ana adımlarını yeniden oluşturur. Retina dejeneratif hastalıklar için hastalık modellemesini ve hücre tedavisini kolaylaştıracaktır. Prosedürü gösteren, bir doktora öğrencisi olan Yuanyuan Guan ve laboratuvardan bir teknisyen olan Bingbing Xie ile birlikteyiz.
50 mL DMEM'e üçüncü 50 kat stok çözümünün 1 mL'sini ekleyerek 50 mL ECM çözümü hazırlayarak başlayın. Ardından, altı kuyulu bir plakanın her kuyusuna hazırlanan bu ECM çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir saat kuluçkaya yatırın. HPSC bakım ortamını üreticinin talimatına göre hazırlayın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına önceden uzadı.
Sıvı nitrojen tankından kriyojenik bir hPSC şişesini 30 saniye boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda kuluçkaya yatırarak dökün. % 75 alkol spreyi kullanarak dikkatlice dezenfekte edin ve bir biyo-güvenlik kabinine koyun. Hücre süspansiyonu şişeden 15 milimetrelik bir tüpe aktarın.
Ardından, hPSC'leri karıştırmak için tüpü hafifçe sallarken, 5 mL pipet kullanarak tüpe 5 mL önceden ısıtılmış bakım ortamı damla damla ekleyin. Tüpü beş dakika boyunca 170 kez G'de santrifüjleyin. Hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 50 mikrolitre süpernatant bırakarak, 1 mL pipet kullanarak süpernatantın çoğunu dikkatlice çıkarın.
Peletin yukarı ve aşağı borulanarak 1 mL bakım ortamı ile yeniden askıya alın. ECM'yi önceden kaplanmış kuyulardan çıkarın ve her kuyuya 1,5 mililitre bakım ortamı ekleyin. Daha sonra her kuyuya 0,5 mililitre hücre süspansiyonu dağıtın.
HPSC'leri düzgün bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın. Hücre yapışmasını teşvik etmek için plakayı en az 24 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre koyun. Her gün ortam değiştirin ve HPSC'leri %80 izdihamda değiştirin.
Gün-0'da, altı kuyulu plakanın bir kuyusundan% 80'lik izdiham hücrelerini çıkararak farklılaşmayı başlatın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi EDTA ayrışma çözümü ile hücreleri toplayın. EDTA çözeltisini çıkarın ve hücre ayrışmasını durdurmak için 10 mikromoler fluvastatin içeren 1 mL bakım ortamı ekleyin.
Hücreleri 1 mL pipetle toplayın. Hücre süspansiyonunu 100 milimetre ultra düşük takılı petri kabına aktarın ve kabın içine 10 mikromoler fluvastatin içeren 9 mL bakım ortamı ekleyin. Hücreleri düzgün bir şekilde dağıtmak için yemeği iki kez hafifçe sallayın.
Daha sonra, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre koyun. Hücreler en az 24 saat kültüre edildikten sonra mikroskop altında gözlemleyin. 15 mL'lik bir boruya 9 mL bakım ortamı ve 3 mL NIM ekleyin.
Hücre kültürlerini 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve önceden ısıtılmış NIM karışımından 10 mL'yi yemeğe ekleyin. Agregaları toplamak için tüpü 3 dakika boyunca 60 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra 5 mL pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve hücreleri kaybetmemek için yaklaşık 500 mikrolitre bırakın.
Karışımın 2 mL'lik kısmını tüpe ekleyin ve süspansiyonu aynı Petri kabına geri aktarın. Hücre agregalarını düzgün bir şekilde dağıtmak için tabağı hafifçe sallayın. Sonra, tabağı inkübatöre geri koyun.
5. Günde, ECM'yi önceden kaplanmış tabaklardan çıkarın ve her yemeğe önceden ısıtılmış 10 mL NIM ekleyin. Ebs içeren tabağı çıkar ve mikroskop altında ES'lerin kalitesini kontrol ederek parlak ve yuvarlak olduklarından emin olun. Tüm EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika yerleşmelerine izin verin.
Ardından, yaklaşık 2 mL orta bırakarak süpernatant çoğunu çıkarın. EB'leri saydıktan sonra, 10 mL NIM içeren kaplamalı yemeklere santimetrekare başına yaklaşık 2-3 EB yoğunluğunda damla damla tohumlayın. EBs'yi düzgün bir şekilde dağıtmak için bulaşıkları hafifçe sallayın ve en az 24 saat boyunca inkübatöre koyun.
28 ila 35 gün içinde bitişik retina pigment epitel ile birlikte morfolojik olarak tanımlanabilir optik vezikülleri mekanik olarak ayırmak için bir tungsten iğnesi veya 1 mL şırıngalı bir iğne kullanın. Askıya almada kültür edin. Retinal organoid oluşumu için 15 mL RDM içeren her 100 milimetre düşük bağlanma kültürü kabına 50-60 optik veziklin koyun.
Ortamı 42.Güne kadar her 2 ila 3 günde bir değiştirin. Retina farklılığını başlatmak için, hPSC'ler küçük kümelere ayrıştırıldı ve 1. 5. Günde EDB'ler EKM kaplı kültür yemeklerine kaplandı ve hücreler yavaş yavaş EB'lerden göç etti.
Gün-16'da, indüksiyon ortamı RDM ile değiştirildi, bu da Nöral retina etki alanlarının oluşmasına ve yavaş yavaş çanaktan çıkıntı yapmasına ve ayrıca RPE hücreleriyle çevrili optik veziklin benzeri yapılar oluşturmasına neden oldu. Günler-28 ila 35 arasında, Nöral retinadan oluşan retina organoidleri, bir RPE küresine bağlanır. Bir tarafta hücreler oluştu.
Retina farklılaşması ve spesifikasyonu ilerledikçe, hPSC'ler, yerel bir insan retinasının mimari özelliklerini taklit ederek yavaş yavaş katmanlar halinde sıralanan nöral retina alt tipleri üretti. Retina ganglion hücreleri ilk olarak retina progenitörlerinden üretilmiş ve nöro retinanın bazal tarafında birikmiş. Bu protokolle retinal organoidler hem zengin çubuklar hem de konilerle son derece olgun fotoreceptörlere dönüştü.
Fotoreceptör hücreleri apikal tarafta, amakrin hücreler, yatay hücreler, bipolar hücreler ve muller glial hücreler ise nöral retinanın ara tabakasında yer aldı. Bu protokolün temel noktaları, yüksek kalitede Ebs oluşturmak ve bunları doğru yoğunlukta tohumlamaktadır.
