Biz RNA arıtma protokolü düzenleme katkılarından dolayı Sacha Reichman ve Dominique Santiard-Baron teşekkür ederim.

1. Journal: Cerrahi Blok gelen örnekler yeniden elde etmek Prosedürü Laboratuarda <ol><li> Ekspres kargo şirketi bir ithalat sözleşme alın. </li><li> Laboratuvar (Telefon numarası ve E-posta adresi) olarak kişi gösteren laboratuvarın posta adresi ile (veya 25) nakliye formları 10 doldurun. </li><li> (Veya 25) 10 hazırlayın örnek formlar 10 (veya 25) 1 sayılı. Bu formlar), hastanın bir) anonim kimlik hakkında bilgi vermek cerrahi tarih ve c) herhangi bir ek açıklamalar cerrah eklemek istiyorum b özel boşluk. 10 (veya 25) yastıklı zarflar (150 x 210 mm) hazırlayın. </li><li> (DEPC) H2O (GHCl) ile tedavi edilen dietilpirokarbonat içinde 6 M guanidin klorür, RNaz içermeyen reaktifler 25 (veya 65), her ml kullanılarak hazırlandı. </li><li> Dolgu 10 veya 25 GHCl çözüm 2.4 ml 5 ml steril polietilen yuvarlak alt tüpler sayılı. </li><li> Basın ti daha, bu tüplerin üst kısmı doldurmak için argon gazı kullanılırghtly cerrahi kabininde depolama birkaç yıldır GHCl çözeltisi oksidasyonunu önlemek için kap. </li><li> 50 ml steril polipropilen konik alt tüp vidalı kapaklı her 5 ml tüpler tanıtmak. 50 ml tüp içine 5 ml tüp tutmak için temiz bir kağıt doku parçası kullanın, tüp kapatın. </li><li> Yastıklı zarflar, nakliye formları, örnekleri formları ile bir karton kutu içine bir polistiren raf ve raf 50 ml tüpler yerleştirin. </li><li> Onların okuma kolaylaştırmak için karton kutusunun kapağının iç: talimatları (1,12-1,19 bakınız) yapıştırın. </li><li> Hastanede kişi posta ile karton kutu gönder. </li></ol> Hastanede <ol start="11"><li> Cerrahi odasına cerrahi kabinden karton kutu getirin. Not Dikkat: prosedürü bir bağışıklık sistemi zayıflamış hasta içeriyorsa, karton cerrahi odasına getirildi olmamalıdır. </li><li> Ameliyat sırasında, retina specim yersayılı 5 ml steril polipropilen içine en GHCl çözümü ile dolu. Tüpü sıkıca kapatın. </li><li> Kısaca Tüp tekrar. </li><li> 10 dakika boyunca kan tüpü külbütör tüp yerleştirin. </li><li> Ekteki örnek numaralı formu doldurun. </li><li> İlgili sayılı 50 ml tüp üzerine kimlik numarası bildirin. </li><li> 50 ml tüp içine cerrahi örnek ile 5 ml tüp tanıtmak, kağıt mendil yerine ve tüp vida. </li><li> Ekteki yastıklı zarf birinde tüp ve içine doldurulmuş örnek form tanıtmak. Kapatın. </li><li> Almak için ekspres kargo şirketi arayın. </li></ol> 2. RNA Arıtma Laboratuarda <ol><li> Tüp yukarı ve aşağı hareket ederken 1 dakika bir homojenizatör ile GHCl çözümü ile 5 ml tüp polipropilen numune homojenize. </li><li> 2 M potasyum asetat, pH 5.0, 270 ul ekleyin. Onun bir çalkalayıcı tüpü yerleştirilerek 10 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanıryatay konumda (420 min-1). </li><li> 20 ° C&#39;de 5000 rpm (6500 xg) 10 dakika santrifüj </li><li> Pelet bozmadan düzgün çözünür fraksiyon aspire. </li><li> Bir 14 ml&#39;lik steril bir tüpe aktarın. </li><li> 100 mM Tris, pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1% 5.3 ml ilave edilir. </li><li> Sezyum Klorür (CsCl) 3.2 g ekleyin ve karıştırın tarafından tüp karıştırın. </li><li> , Steril bir 11 ml&#39;lik santrifüj tüpüne polyallomer CsCI / etilen-diamintetraasetik asit (EDTA), 1.8 ml ilave edilir. </li><li> 10 ml&#39;lik steril bir Pasteur pipeti ile, yoğunluk yastık rahatsız etmemek için tüpün kenarına yavaş kaydırarak 1.8 mi CsCI / EDTA üzerine RNA çözeltisi aktarın. </li><li> Rotor içine tüpler (retina gerekirse olmadan tampon içeren ikinci bir tüp) yerleştirin. </li><li> 20 ° C&#39;de 32.000 rpm (225,000 xg) 24 saat santrifüj </li><li> Steril bir Pasteur pipeti ile çözüm üstün parçası kaldırmak, ve atın. </li><li> Kontrol ederken yavaş yavaş çıkarınDNA (viskoz) ikinci bir steril Pasteur pipet ile aspire, ve atın bir an. </li><li> Üçüncü bir steril Pasteur pipeti ile RNA pelet serbest bırakmak için özen kalan çözüm çıkarın. </li><li> Ile tüp bölümü altındaki bir neşter alev sterilize edilmiş, sonra steril bir ters bakışları borunun geri kalan kısmı koydu. </li><li> Tüp ters ve GHCl 160 ul ile ince durulayın. </li><li> 10 dakika pelet kurumaya bırakın. </li><li> 150 ul (- 1 mM EDTA -% 0.1 SDS, 10 mM Tris, pH 7.5) içinde pelet yeniden süspanse edin. </li><li> 2 ml steril mikrosantrifüj tüpü içine transfer çözeltisi, daha sonra 30 ul (- 1 mM EDTA -% 0.1 SDS, 10 mM Tris, pH 7.5) ile kalıntı pelet hasat. </li><li> 150 ul (- 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.5) ilave edilir. </li><li> 3 M sodyum asetat, pH 5.0, girdap tüpün 30 ul ekle. </li><li> Etanol% 100 (-20 ° C), vorteks tüpün 900 ul ekleyin. </li><li> Erime buz tüpü 30 dakika yerleştirin. </li><li> Cen4 ile 15,000 rpm&#39;de 30 dakika tüp ° C trifuge </li><li> Ince çözünür fraksiyon aspire, ve atın. </li><li> 500 ul% 70 etanol (RT), girdap tüp ekleyin. </li><li> 4 az 15.000 rpm (18.000 xg) tüp 20 dakika ° C santrifüj </li><li> Durulama basamağı (% 70 etanol) tekrarlayın. </li><li> Kısaca santrifüj ve bir P200 pipet ile kalan etanol ortadan kaldırır. </li><li> 10 dakika için pelet hava kurumasını bekleyin. </li><li> 50 ul DEPC ile tedavi edilen H 2 O içinde pelletini tekrar </li><li> Vorteks şiddetle karıştırın. </li><li> Bir su banyosu içinde 45 ° C&#39;de 15 dakika ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> 3. Jel Elektroforez RNA Analizi <ol><li> Bir kimyasal kaput içinde bir agaroz jel dökün. </li><li> Steril bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde, analiz edilecek RNA 2 ul ve örnek hazırlık tampon 6.4 ul ekleyin. </li><li> Ikinci bir 1.5 ml lik tüp içinde, RNA standartları 3 ul ve örnek hazırlık tamponu 9.6 ul ekleyin. </li><li> 65, tüpler 15 dakika ısıtın ° C, Buz koydu. </li><li> RNA örnek tüpü ve RNA standartları tüp boya ile 1 ul EB yükleme tampon boya olmadan 1 ul etidyum bromür (EB) yükleme tamponu ekleyin. </li><li> Bir boya (bromofenol mavisi) jelin alt 2/3 ulaşıncaya kadar akan tampon kimyasal bir başlık içinde 100 V, - 80 altında jel çalıştırın. </li><li> Jel 250 ml iyonu DEPC işlenmiş 2x SSC ile iki kere 15 dakika çalkalayın. </li><li> UV aydınlatma altında dijitalize edilen görüntü almak. </li><li> Üst bant (23S rRNA) ve alt bant (16S rRNA) arasındaki oranı hesaplar. </li></ol> 4. RNA son saflaştırma <ol><li> DEPC ile tedavi edilen H 2 O (gerekirse) ile 100 ul RNA örnek hacmi ayarlayın. </li><li> 100 ul fenol asit (1 mi fenol sodyum asetat, pH 5.2, 50 mM DEPC işlenmiş H2O + 130 ul içinde doyurulmuş) kuvvetli bir şekilde karıştırın. Ekleme </li><li> Oda sıcaklığında 13.000 rpm&#39;de (15000 x g) de 10 dakika santrifüj yapılır. </li><li> RecoveR, yeni bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine sulu faz (üst faz) ve dikkatli bir şekilde aktarılır. </li><li> 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve etanol içindeki 250 ul% 100 (-20 ° C) 10 ul ekle. </li><li> Erime buz içine tüp 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 4 de 14.000 rpm (18,000 xg), tüp 30 ° C dakika santrifüj </li><li> Dikkatlice aspire çözünebilir fraksiyon ve atın. </li><li> 500% 70 etanol ul (oda sıcaklığı) ve tüp vorteks ekleyin. </li><li> 4 de 14.000 rpm (18,000 xg), tüp 20 ° C dakika santrifüj </li><li> Durulama basamağı (% 70 etanol) tekrarlayın. </li><li> Kısaca santrifüj ve bir P200 pipet ile kalan etanol ortadan kaldırır. </li><li> Hava 10 dakika süre ile pellet kuruması beklenir. </li><li> DEPC işlenmiş H 2 O. 50 ul içine pelletini </li><li> Sonra 45 tüp 15 dakika ° C inkübe </li><li> RNA numunesinin üzerine 2 ul 260 nm ve 280 nm&#39;de absorbans (ABS) ölçün. Oranı Abs260/Abs280 hesaplanmıştır. </li> &lt;li&gt; Mağaza -80 RNA örnek ° C (birkaç yıldır istikrarlı). </li></ol> 5. Çözümler ve Temizleme Prosedürleri <ol><li> Potasyum asetat 2 M, pH 5.0: DEPC ile muamele H 2 O., 70 ml içine 19.6 g potasyum asetat çözülür DEPC işlenmiş H 2 O ile 5 durulama ardından, 15 dakika boyunca 1 M NaOH ile içine ıslatarak pH metre prob temizlemek Asetik asit ile pH 5.0 &#39;a ayarlayın ardından DEPC ile muamele H 2 O ile 100 ml hacim ayarlama </li><li> Tris-HCl, 100 mM, pH 8.0, N-Lauroylsarcosine 1:% 0.5 M Tris-bazlı bir pH 8.0 40 ml N-Lauroylsarcosine 2 g (bir davlumbaz altında) çözülür. ) DEPC tedavi H 2 O ile 200 ml ses seviyesini ayarlamak CSCL / EDTA: DEPC tedavi H 2 O ile hazırlanan 50 ml 10 mM EDTA pH 7.5 CSCL 96 g Otoklav ve DEPC ile tedavi edilen H 2 O ile 100 ml ses seviyesini ayarlamak PH &lt;7.5 olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Agaroz jel% 1: 62 ml DEPC tedavi H 2 O içinde agaroz 1 g koyun Bir mikrodalga fırında kaynatın. 12.3 M, 18 mlformaldehit, 5x MOPS 20 mi. Bir kimyasal kaput içinde dökün. </li><li> Örnek hazırlık Tampon: hazırlanan hazırlıksız olmak. 5x MOPS, 12.3 M formaldehit ve formamidin 40 ul 16 ul arasında kimyasal bir kaput 8 ul içinde karıştırın. </li><li> EB yükleme tamponu (boya olmadan): hazırlanan hazırlıksız olmak. DEPC işlenmiş H 2 O. ile hazırlanan% 80 gliserol, 20 ul halinde 4 ul 10 mg / ml etidyum bromür ekleyin </li><li> EB yükleme tamponu (boya ile): hazırlanan hazırlıksız olmak. % 0.25 ksilen cyanol, DEPC ile muamele H 2 O ile% 0.25 bromofenol mavisi ihtiva eden% 80 gliserol, 10 ul içine 2 ul 10 mg / ml etidyum bromür ekleyin </li><li> Tampon Koşu: 60 ml 5x MOPS için, 12.3 M formaldehit 54 ml DEPC ile tedavi edilen H 2 O 186 ml </li><li> Karıştırarak, 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca% 0.1 v / v dietilpirokarbonatla inkübe damıtılmış su ° C: H 2 O DEPC ile muamele edildi. Otoklav ile sterilize edin. </li><li> Homojenleştiriciyi temizlenmesi: 1 L temizlik çözeltisi, 25 ml (RBS) ekleyin DEPCH2O muamele edilmiş ve karıştırma ile eksen 1 dakika immerge. 60 ° C&#39;de 2 saat inkübe ° C. Alüminyum içine DEPC ile tedavi edilen H 2 O Wrap aracı ile iyice durulayın ve alet kutusuna koydu. Kutusu sarın. Otoklav ile sterilize edin. </li><li> Elektroforez cihazı Temizleme: cihazı, tepsi ve 15-kuyu tarak yıkayın. % 3 hidrojen peroksit oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. % 100 etanol ile bir kez yıkayın. Hava kuru. </li><li> Cam temizlik yemekler: tüm gece cam yemekleri RBS 2% temizleyin, daha sonra 200 ° C&#39;de sterilize edilmeden önce distile su ile durulayın </li></ol>

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Cerrahi blok doku kurtarma için bir prosedürün geliştirilmesi retina dekolmanı transcriptome analizi için gerekli olmuştur. Bir cerrahi bu tip acil durumlarda ve göz doktorlarının çalışma, faaliyet zaman biyolojik bir araştırma programına katılmak için çok az zaman var uygulanan olduğunu dikkate almalıyız. Bu retinektomi da istatistiksel numaraları ulaşmak için daha kolay bir şekilde bir ağ ile çalışmak, böylece her hizmet stokastik gerçekleştirilir. Bu ağ olarak, doku toplama standardi...

Retina dekolmanı temel tedavi amacı (RD) retina pigment epitel hücrelerinden fotoreseptör ayrılması kaynaklanan fotoreseptör hücre hasarı ve retina iltihabı sınırlamak için bir yol bulmaktır. RD sırasında, RPE hücreleri dediferansiye, göç, aktive edilir ve komplikasyonlara yol açabilir kasılma güçleri uygulamakla, müstakil retina yüzeyinde çoğalırlar. RD transkriptomik analizi RD ve cerrahi ile birlikte son görme sonucu geliştirmek dolayısıyla gelecekteki tedavi molekülleri takip modifiye ifade ile hedef genleri tanımlamak için bir yoldur. İyi deoksiribonükleik asit (DNA) olarak ribonükleik asit (RNA) sabit değil bilinen, genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır ikincisi, istikrarı 2 eski 30.000 &#39;den fazla yıllık paleontolojik örneklerinden Neandertal genomunun diziliminin izin vardı. Haberci RNA&#39;ya genomundan genlerin DNA transkripsiyonbüyük gen ifadesinde süreci ve mRNA bir sinyal teşkil için kararsızdır. RNA&#39;lar sinyal sona RNAse enzimler tarafından çok hızlı bir şekilde bozulmuş. Ifade bir araştırma laboratuvarında incelenmiştir önce dokularının organizma izole zaman, RNA&#39;lar çok sık bozulmuş. Bozulmuş RNA analizi gen ekspresyonu için uygun değildir. Laboratuvar personeli ameliyat katılamazlar çünkü, biz kolay bir prosedür geliştirdiği ve sadece cerrah uygun RNAse-ücretsiz bir çözüm içine dokuları kurtarmak için gerektirir. Dokuların RNA stabildir ve bu çözelti, oda sıcaklığında, 72 saat sonra herhangi bir bozulma işareti olmadan analiz edilebilir. Örneklerden RNA&#39;lar laboratuar 3 aktarıldıktan sonra, bir sezyum klorür gradyanı üzerinde ultrasantrifügasyon, bir içeren bir standart yöntem ile saflaştırılır. Daha sonra, RNA kalitesi agaroz jel elektroforezi ve RT-PCR ile incelenmiştir. RNA saflaştırma protokolü vardırDNA ve RNA için farklıdır ve RNA geni ekspresyon çalışmalarında yapısından sinyaller üretecek bir DNA molekülü tarafından kirlenmemesini sağlar kendi yoğunluğuna göre moleküllerin ayrılması avantaj sağlar. Buna ek olarak, sayısal olarak bir hücre içinde en bol RNA olan transferi RNA&#39;lar (tRNA), ribozomal RNA (rRNA) ve haberci RNA&#39;lar (mRNA), olmak bu iki sonuncusu, aynı fiziksel özelliğine göre ayrılır arıtma sürecinin ürünü sonunda. Mikrodizi analitik protokolleri en tRNA, 4-6 tarafından inhibe ters transkriptazlar, ve RNA polimerazlarının kullanımının, çünkü dahil hazırlanmasından tRNA kaldırılması yararlıdır. Cerrahi örneklerden saf RNA standart bir protokol kullanarak etiketli ve bir mikroarray çip melezleşmiştir ve sonuçları iki tamamlayıcı yöntem, yanlış keşif oranı yöntemi kullanılarak ve karşılıklı bilgi ve visuali dayalı yeni bir yöntem kullanılarak analiz edilmektedir edilirWeb-tabanlı sunucu Retinobase 7,8 üzerinde zed.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

Retina dekolmanı (RD) retina pigment epiteli (RPE) gelen nörosensöriyel retinanın bir ayrılık açıklar. RPE ışığa duyarlı nöronlar, fotoreseptör normal fonksiyonu için gereklidir. RPE, retina dekolmanı hücre dışı sıvı ile dolu bir fiziksel boşluk oluşturur. RD nörosensöriyel retina ve iyonları ve metabolitleri fizyolojik değişim ciddi tedirgin çünkü RPE hem etkileyen hücresel ve moleküler yan etkiler başlatır. Vizyonu için sonucu vizyonu 1 restorasyon iki doku sonuçları hızlı bir reapposition beri dekolmanı süresi ile ilgilidir. RD tedavisi sadece cerrahidir. Vitreus jeli (vitrektomi) çıkarılması retina dekolmanı lehine müstakil alanı çevresinde retina kaldırılması olmayan parçası takip eder. Kaldırılan retina örnekleri res nullius (bir şey) ve dolayısıyla normal atılır.Bu cerrahi örneklerden RNA kurtarmak için, laboratuvara cerrahi blok aktarımı sırasında RNA koruma sağlar prosedürü dergi geliştirdi. Ayrıca sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol saflaştırılmış RNA&#39;lar küresel gen ekspresyon analizi için uygun olduğunu sağlamak için. RNA kalitesi hem RT-PCR ve mikroarray analizi ile doğrulandı. Verilerin analizi RD iltihap ve fotoreseptör dejenerasyonunun bir anda tutulumu görülmektedir.

Prosedür Dergisi (Şekil 1) bize saflaştırılmış RNA için cerrahi blok retina örnekleri kurtarmak ve retina dekolmanı transcriptome analiz etmeyi sağlar. Monosit kemotaktik MCP1 gen CCL2, en upregülasyonu ve gen GNAT1, kısa dalga koni opsin OPN1SW ve homeogene CRX (Şekil 2) iletici çubuk fotoreseptör ifade azalma retina dekolmanı sonuçları. GNAT1, OPN1SW ve CRX eş zamanlı olarak indirgenmesi fotoreseptör dejeneras...

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl at JoVE.com

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Biz retina dekolmanı bir transkriptomik analizi için retinektomi gelen retina örnekleri kullanılır. Ayrıca, cerrahi blokları ve laboratuar arasında RNA koruma sağlayan bir işlem geliştirilmiştir. Biz saflaştırılmış RNA mikroarray analizi için uygun olduğunu sağlamak için sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol.

Journal kullanarak İnsan Retina Cerrahi Örneklerinin transkriptomik Analizi

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K Görüntüleme.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. Biz retina dekolmanı bir transkriptomik analizi için retinektomi gelen retina örnekleri kullanılır. Ayrıca, cerrahi blokları ve laboratuar arasında RNA koruma sağlayan bir işlem geliştirilmiştir. Biz saflaştırılmış RNA mikroarray analizi için uygun olduğunu sağlamak için sezyum klorür Ultrasantrifügasyon RNA arındırmak için standart bir protokol.

Video: Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Cerrahi Örneklerinin tümör eksplantlarındaki Roman Anti-Kanser İlaç Geliştirme Yöntemi


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Tıp

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Histerektomi Örneklerden İlköğretim İnsan endometrial stroma hücrelerinde Kurulması İçin İki Yöntem

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Tavşanlarda Subretinal Cerrahi Adım Protokolle Bir Adım

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Tümör ilişkili damarlara kullanmanın intravital mikroskobu gelişmiş Dorsal deri kıvrım pencere Chambers transgenik floresan fareler üzerinde

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. Recent technological progress has enabled the fabrication of microelectrode arrays that allow recording the activity of multiple individual neurons in the neocortex of the human brain. These arrays have the potential to bring unique insight onto the neuronal correlates of cerebral function in health and disease. Furthermore, the identification and decoding of volitional neuronal activity opens the possibility to establish brain-computer interfaces, and thus might help restore lost neurological functions. The implantation of neocortical microelectrode arrays is an invasive procedure requiring a supra-centimetric craniotomy and the exposure of the cortical surface; thus, the procedure must be performed by an adequately trained neurosurgeon. In order to provide an opportunity for surgical training, we designed a procedure based on a human cadaver model. The use of a formaldehyde-fixed human cadaver bypasses the practical, ethical and financial difficulties of surgical practice on animals (especially non-human primates) while preserving the macroscopic structure of the head, skull, meninges and cerebral surface and allowing realistic, operating room-like positioning and instrumentation. Furthermore, the use of a human cadaver is closer to clinical daily practice than any non-human model. The major drawbacks of the cadaveric simulation are the absence of cerebral pulsation and of blood and cerebrospinal fluid circulation. We suggest that a formaldehyde-fixed human cadaver model is an adequate, practical and cost-effective approach to ensure proper surgical training before implanting microelectrode arrays in the living human neocortex.

We designed a procedure in which a formaldehyde-fixed human cadaver is used to assist neurosurgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain.

Bir insan Kadavra formaldehit sabit modeli kullanarak Neocortical elektrot dizilerin implantasyonu için cerrahi eğitim

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

İnsan Brucellar Spondilodistis Tanı ve Cerrahi Tedavisi

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Uyuyan Güzel Transposon Transposon Transfected İnsan Retina Pigment Epitel Hücrelerinde Oksidatif Stresin İndüksiyonu ve Analizi

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...