Bu yöntem kemik tümörü araştırma için fonksiyonel iskelehazırlamak için etkili bir strateji sağlar. Kemik ekstraselüller matriks desellize, osteosarkom hücrelerinin sağkalım ve faaliyetleri için değişken seropatigösterdi. Bu tekniğin en büyük avantajı kemik kaynaklı matriks osteosarkom hücrelerinin klinik osteosarkom histopatolojisine benzer yüksek heterojen morfoloji göstermesidir.
Bu yöntem osteosarkom, Ewing sarkomu ve diğer malign tümörlerin kemiğe metastazı gibi kemik tümörlerinin ilaç hassasiyetlerinin gelişimini, ilerlemesini araştırmak için ideal bir model sağlar. Başlamak için, steril cerrahi makas kullanarak bir fare ötenazi sonra, dört ila altı haftalık BALB / c fareler elde, taze fibula kesti, tibia, ve bir arka ekstremite uyluk uyluk. Cımbız yardımıyla, epitel doku soyma, ve sonra mümkün olduğunca yumuşak doku kadar kaldırmak.
Altı santimetrelik bir tabaktaki kanı çıkarmak için bacak kemiklerini steril 10 mM PBS solüsyonu yla iki kez durulayın. Kemikleri üç dakika boyunca %75 etanol ile bir tabağa batırın ve iki kez PBS ile durulayın. Temiz kemikleri steril 50 mililitrelik santrifüj tüpünde steril PBS tüpü yle 80 santigrat derecede saklayın.
Donmuş kemikleri oda sıcaklığında eritin ve bir saat boyunca 80 derecede tekrar dondurun. Kemikleri hücre likisi ve doku bozulması için ikiden fazla donma-çözülme döngüsüne tabi tart.rölanti. Sonra, steril bir 50 mililitre santrifüj tüp 0.5 normal HCl ile dolu kemikleri yerleştirin ve kemiklerin tam ve eşit kapsama sağlamak için nazik sallayarak bir yörünge shaker oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka.
Kireçlenmeden sonra hidroklorik asit çözeltisini tamamen decantın ve akan suyun altındaki kemikleri bir saat durulayın. Daha sonra, orbital shaker üzerinde yıkama başına 15 dakika boyunca iki kez kemikleri yıkamak için distile su kullanın. Çözeltiyi tamamen dekant.
Demineralize kemiklerde lipidler ayıklamak için, metanol ve kloroform 1:1 karışımı ile 50 mililitrelik santrifüj tüp kemikleri yerleştirin. Kloroform ayrışmayı önlemek için ışığı önlemek için tüpü folyo ile sarın. Ve tüpü bir saat boyunca orbital shaker'a koy.
Sonra, 30 dakika kalay folyo ile metanol başka bir tüp içine kemikleri aktarmak için cımbız kullanın. Metanol tamamen çıkarın ve bir orbital shaker üzerinde 15 dakika boyunca iki kez distile su ile yıkayın. Decant son yıkama suyu ve steril koşullar altında devam edin.
Kemikleri altı santimetrelik bir tabakta steril PBS ile üç dakika durulayın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne 40 mililitre steril %0,05 TE çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede karbondioksit kuvözde 23 saat boyunca inkübasyon kemikleri. TE çözeltisini atın ve 90 g/mL ampisilin ve 90 g/mL kanamisin ile desteklenen steril PBS ile iki kez iki kez orbital shaker'da 15'er dakika boyunca durulayın.
Son yıkama tamamen decanting sonra, antibiyotikler ile steril PBS 40 mililitre ile tekrar yeniler. Gözenekli alanların etkili sterilizasyonunu sağlamak için hafif sallayarak oda sıcaklığında 24 saat boyunca iyice yıkayın. Sonra, antibiyotikler ile steril PBS ile dolu bir 50 mililitrelik santrifüj tüp içine kemikleri aktarın.
Hazırlanan Kemik Ekstrasellüler Matris iki ay boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. BEM'i bir tabağa %75 etanol batırın ve 30 saniye boyunca yavaşça elle sallayın. Sonra PBS ile 30 saniye, iki kez durulayın.
BEM'i temiz bir altı kuyulu hücre kültür plakasına aktarın. Her kuyuya iki mililitre tam kültür ortamı ekleyin. BEM'i bir gecede karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Gösterge fenol kırmızısı içeren önceden ısıtılmış PBS 100 mikrolitre insan işletim sistemi hücre hatları elde edin. 5 yaklaşık konsantrasyonu 1 kez 10 ile 5 os hücreleri askıya almak için bir pipet kullanın. BEM tamamen orta batırılmış sonra, proksimal veya distal epifiz, BEM medüller kavite için iğne delmek ve BEM içine işletim sistemi hücreleri enjekte.
Enjekte edilen hücrelerin BEM'e sıkıca yapışmasını sağlamak için OS-BEM modelini 37 santigrat derecede nemlendirilmiş %5 karbondioksit atmosferinde en az iki saat kuluçkaya yatırın. Sonra, kuvözden tabağı çıkar. Tabağa bir mililitrelik kültür ortamı ekleyin ve BEM kültürünün yüzeyini tamamen kaplamak için bir gece boyunca kuvözde saklayın.
OS-BEM modelini steril bir cızırdayan altı kuyunun yeni bir kuyusuna yavaşça aktarın ve bir mililitrelik taze kültür ortamını yeniden besleyin. Kültür kuvözde 14 gün boyunca model. 14 günlük kuluçka süresi boyunca orta renkleri izlemeye devam edin.
Ortam turuncuya, hatta sarıya dönerse, eski ortamın yarısını atarak ve işletim sistemi hücreleri için sağlıklı bir ortam sağlamak için yeni bir ortam ekleyerek ortamı hemen yenileyin. Ters floresan mikroskobu altında hücre durumunu izlemeye devam edin. İşletim sistemi hücreleri tabağa genişlettiğinde, OS-BEM modelini steril cımbızlı yeni bir kuyuya nazikçe aktarın.
14 günlük kültürden sonra, kültür ortamını kaldırmak için OS-BEM modelini PBS ile hafifçe durulayın. Sonra 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve histolojik tanımlamayı düzeltmek için %10 tamponlu formalin ekleyin. Demineralizasyon ve desellülerizasyondan sonra BEM, yerli fare kemiğine göre daha güçlü esneklik ve azmi ile yarı saydam görüner.
Medüller kavite alanında biraz kas kalıntısı açıkça görülebilir. Yerli kemik ve hücredışı BEM parlak alan görüntüleme, hücre çekirdeklerinin tam olarak çıkarılmasını gösterir. Kollajen ağ düzenlemesindeki doğal gözenekli yapı, hücredışı BEM'de iyi korunmuştür.
Ayrıca, Kollajen I ve Kollajen IV için immünohistokimyasal boyama ekstrasellüler matriks ana bileşenleri decellularization sonra fare tibia korunur gösterir. 14 günlük kültür boyunca, hem periost hem de endosteum işletim sistemi hücrelerinin genişlemesi ile sızmış. Hücreselloz BEM'deki OS hücreleri, os kesitinin sitopatolojik özelliklerine benzer yüksek heterojen morfoloji gösterir.
BEM modelinde 14 gün boyunca kültürlendikten sonra yapılan immünohistokimyasal analizler uzun süreli kültürlerde büyük avantajlar göstermektedir. Ayrıca, işletim sistemi hücreleri ve BEM kültürü, yüksek ekspres kemik matris glikoprotein, osteoid matriks için özel olan. Bu in vitro's üç boyutlu modeli bir henotypik heterojenlik ve başarı ile osteosarkom dedifferentiation düzenleyici bir mekanizma göstermek için kullanılmıştır.
