Üç boyutlu tümör sheroidler vivo tümörlerin dokuya özgü özelliklerini taklit edebilir, basit 2D hücre kültürü daha anti-kanser ilaç keşfi için daha klinik olarak ilgili veriler sağlayan. Görüntüleme tekniğimiz, optik koherence tomografi, birkaç yüz mikron boyutu ile, tek bir tümörlü sinirlerin 3D yapısını kolayca görselleştirebilir ve morfolojisi ve iş infest daha doğru karakterizasyonu sağlamak, genellikle birkaç saniye içinde. 3D küresel modeli kullanarak potansiyel olarak ilaç keşif zaman çizelgesi kısaltabilir, maliyeti azaltmak ve hastalara daha etkili yeni ilaç getirmek.
Tümör kümesinin küresel şeklini oluşturmak deneyimizin kritik bir adımıdır. Yuvarlak alt ile doğru ultra-düşük eki plaka seçmek önemlidir, ve hücre tohumlama sonra uygun santrifüj hızı. Bu deneyi, el yazmasında açıklandığı gibi bir kültür şişesinde ilginç hücreler büyüterek başlatın.
Hücreleri standart koşullar altında bir kuvözde saklar ve sağlık durumlarını her gün izleyin. Ortamı gerektiği gibi yenileyin. Çok kuyulu plakalarda 3D hücre kültürünü gerçekleştirmek için, ilk hücre kültürü şişesi orta kaldırmak ve sterilize hücreleri yıkayın, 33 derece Santigrat önceden ısıtılmış PBS.
Sonra hücreleri yeniden askıya almak ve 37 santigrat derece üç dakika kuluçka için Trypsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Trypsin seyreltmek için kültür orta üç mililitre ekleyin. Bu hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 500G'de santrifüj ve oda sıcaklığında beş dakika bekleyin.
Sonra supernatant çıkarın ve önceden ısıtılmış kültür orta dört mililitre ile hücre pelet resuspend. Hücre konsantrasyonu belirlemek için, bir hemositometre üzerine örnek bir damla hypat, ve hücreleri saymak. İstenilen tohumlama konsantrasyonuna seyreltin.
Tohum 200 hücre süspansiyon her kuyuiçine ultra-düşük eki, yuvarlak-alt çok kuyulu plaka, bir konsantrasyon 3, mililitre başına 000 hücre, iyi başına yaklaşık 600 hücre elde etmek için. Tohumlamadan hemen sonra, tüm tabağı oda sıcaklığında, yedi dakika boyunca mevcut en düşük hızda santrifüj edin. Tabağı 37 santigrat derece ve %5 Co2'de kuvöze yerleştirin ve her üç günde bir ortamı yenileyin.
İlk olarak, bu makaledeki şemaları izleyerek OCT sisteminin referans kolunu ve örnek kolunu oluşturabilirsiniz. Daha sonra, bir kilometre, bir dereceleme, bir F-Theta lens ve bir çizgi tarama kamera dahil olmak üzere spektrometre, inşa. Çok kuyulu plakayı sabit bir konumda tutmak için bir plaka bağdaştırıcısı kullanın.
Görüntülemeden önce, 2B yatırma aşaması nı ve farklı kuyulardan gelen odak düzleminin varyasyonuna en aza indirmek için geçiş aşamasına monte edilmiş bir dönüş aşaması kullanarak çok kuyulu plakanın eğim ve dönüşünü düzeltin. Ardından, plakanın kenarlarının sahne hareketinin yönüyle paralel olduğundan emin olmak için döndürmeyi ayarlayın, böylece kuyular OCT görüntülerinde aynı yatay konumlarda kalır. Daha sonra, plakanın optik tabloya paralel olduğundan emin olmak için yatırma aşamasını ayarlayın, böylece kuyular görüntüleme için aynı dikey konumlarda kalır.
Tümör küreseloidlerin görüntülenmesi nin olduğu gün, çok kuyulu plakayı kuvözden çıkarın. OCT görüntüleme sistemi altında aktarın ve plaka adaptörü üzerine yerleştirin. Plakanın yüksekliğini ayarlamak için, çeviri aşamasının Z yönü boyunca hareket ettirin.
Özel görüntüleme yazılımında, gelişim aşamalarına bağlı olarak tüm tümör küreselliğini kapsayacak şekilde istenilen bir OCT tarama aralığı ayarlayın ve ayarı kaydetmek için parametreleri kaydet'e tıklayın. Daha sonra tümör küresellerinin optimize edilmiş XZ ve YZ OCT önizlemelerini gösterin. Spheroidler içeren plaka tüm kuyular için tümör spheroids tek tek 3D OCT görüntüleri elde.
Önizleme görüntüsünü görüntülemek için önizleme düğmesini tıklatın. OCT görüntüsünü elde etmek için edinme düğmesini tıklatın. OCT veri toplama işleminin genel aşama taşıma işlemini kaydedin.
Tüm tümör spheroidleri için en uygun görüntü kalitesini sağlamak için plaka adaptörlerinin doğru bir şekilde ayarlanabilmesi ve ortanca hacmin aynı olması gerekir. OCT yapısal görüntüler oluşturmak için tümör küresel lerinin 3D OCT veri kümelerini işlemek için özel bir C+işleme kodu kullanın. Küresel görüntülerin kolajını oluşturmak için küresel oidin santrifüjündeki üç kesitsel, XY, XZ ve YZ düzleminde 2B OCT görüntüleri kullanın.
İstenilen bir yazılım kullanarak küresel in 3D görüntülenmesini elde etmek için, önce SD OCT verilerini yazılıma yükleyin. Üstle panelini tıklatın, ardından yeni birim ekleyin ve 3B işleme için kullanılacak karışım modunu seçin. Görüntüleme açısını ayarlamak için, görüntüyü sürüklemek ve el yazmasında açıklandığı gibi niceliksel olarak devam etmek için fare işaretçisini kullanın.
HCT116 hücre hattı spheroidlerinin etkilenmemiş OCT görüntülerinin bir kolajı işlenmiş verilerden üretilmiş ve sonuçlar diğer 2D yüksek işlemli görüntüleme sistemlerinin görüntüleriyle karşılaştırılabilir. Ayrıca, 96 kuyudan 2D kesitsel küresel görüntülerin kolajı küresel yükseklikleri izlemek ve dikey yönde küresel inhomogeneity görselleştirmek için oluşturuldu. 3D işlenmiş küresel görüntülerden oluşan bir kolaj, genel 3B şekli görselleştirmek ve küresel oidin yuvarlaklığını değerlendirmek için önceden tanımlanmış herhangi bir açıdan oluşturulabilir.
Genel OCT post-processing sonrası tümör küresel oidin 3D OCT yapısal görüntüleri elde edilmiştir. OKT verilerinden, tümör sferoidinin yapısını herhangi bir yönde görselleştirmek için 3Boyutlu yüzey direğine ve XZ, YZ ve XY ortogonal dilimler oluşturuldu. Çapı, yüksekliği ve voksel bazlı hacmi karakterize etmek için tek bir tümörün uzunlamasına takibi yapıldı ve 21 günlük gelişim sırasında boyut ve hacim olarak büyüme eğrileri ortaya çıktı.
Burada, küresel 11. Uzunlamasına takip tümör spheroid ölü hücre alanlarının artış gösterdi. Tümör spheroid 3D render görüntüleri görünüm ve ölü hücre bölgelerinin büyüme gösterdi gün yedi gün 14, kırmızı vurgulanmış nekrotik alanların artması ile gösterildiği gibi.
Nekrotik alanların yüzdesi arttıkça, tümör küresel mükemmel şeklini koruyamadı ve bu nedenle çöktü. Bu görüntüleme platformu ile daha iyi in vivo tümörleri simüle etmek için 3D görüntüleme modeli, geniş yaratık modeli ve co-kültür modelleri gibi diğer karmaşık tümör küre modelleri, keşfedebilirsiniz. Bizim yüksek iş itimat OCT görüntüleme sistemi kanser ilaç keşfi ilaç tarama için alternatif bir yaklaşım sağlayabilir.
Bu da karakterize bir şey, çeşitli biyomedikal uygulamalar için 3D biyofabrikasyon örnekleri.
