Bu protokol, hücre içindeki ribozomların aktivitesi hakkında moleküler ayrıntıları ortaya çıkaran bir polizom profilinin nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu teknik, kullanıcıların otomatik gradyan fraksiyonasyon sistemlerine erişimi olmayan bir polizom profili tarafından sağlanan değerli bilgileri elde etmelerini sağlar. Degradeleri hazırlarken zaman ayırın ve gradyanları, doğrusal bir gradyana yerleşirken bir kompresör veya diğer mekanik işlemler tarafından bozulmayacakları bir yerde saklayın.
Başlamak için, sakkaroz gradyan tamponunda% 7 ve% 47 sakkaroz stok çözeltileri hazırlayın. Filtre, sakkaroz stok çözeltilerini 0,22 mikronluk bir filtreyle sterilize eder. %7 ve %47'lik stok çözeltilerini dağıtarak ve karıştırarak 17, 27 ve %37 oranında sakkaroz çözeltisi hazırlayın.
Altı polipropilen santrifüj tüpünü tam görünümlü bir test tüpü rafına yerleştirin. Tüpler arasında yeterli boşluk olduğundan emin olun, böylece bir tüple yapılan hareketler diğerlerini rahatsız etmez. Üç mililitrelik bir şırıngaya künt uçlu dokuz inçlik, 22 gauge bir iğne takın ve şırınganın gradyanları ayarlamadan önce sakkaroz çözeltisini damlamadan tutabilmesini sağlamak için bir test dolgusu yapın ve dağıtın.
Her santrifüj tüpünün dibine iki mililitre %7 sakkaroz ekleyin. Daha sonra, iğne ucunu tüp tabanının hemen yakınına yerleştirerek% 7'lik çözeltinin altına% 17 sakarozun iki mililitresini ekleyin. Çözeltiyi dikkatlice ve yavaşça dağıtın.
Prosedürü% 27, 37 ve% 47 sakkaroz çözeltisinin her biri iki mililitre ile tekrarlayın, her katmanın diğerinden yoğunlukların ayrılmasını gösteren bir çizgi ile ayırt edilebilmesini sağlayın. Gradyanları, sürekli, artan bir sakkaroz yüzdesine yerleşmelerini sağlamak için gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Mayanın büyümesi ve toplanmasından sonra, Saccharomyces cerevisiae hücreleri, soğutulmuş 700 mikrolitre polizom ekstraksiyon tamponunda hücreleri yeniden askıya alır.
100 birim RNAse İnhibitörü ekleyin. Ardından, yaklaşık 425 ila 600 mikron boyutunda 400 mikrolitre önceden soğutulmuş cam boncuk ekleyin. Karışımı cam boncuklarla 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve maya hücrelerini beş dakika boyunca bir boncuk çırpıcıda kuvvetli ajitasyonla bozun.
Hücreleri bozduktan sonra, santrifüjleme ile lizatı netleştirin. Floresan tabanlı bir RNA algılama sistemi kullanarak, absorbansı 260 nanometrede ölçerek arıtılmış lizattaki RNA konsantrasyonunu belirleyin. RNA konsantrasyonunun mikrolitre başına 0,5 ila bir mikrogram olduğundan emin olun.
RNA konsantrasyonu çok düşükse, hücreleri askıya almak için kullanılan ekstraksiyon tamponunun hacmini azaltın. Lisatı dikkatlice gradyanların üstüne yükleyin. Pipet ucunu polipropilen tüpün üst kısmındaki iç duvara yaslayın.
Tüpü açın ve lizatı yavaşça gradyanın üstüne dağıtın, duvara doğru sürün. Tüpleri yavaşça sallanan bir kova rotorunun önceden soğutulmuş kovalarına yerleştirin ve gradyanları santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, santrifüj tüplerini sallanan kova rotorundan dikkatlice çıkarın ve bir tüp tutucuya yerleştirin.
Fraksiyonları saklamak ve buz üzerinde önceden soğutmak için 96 kuyucuklu plakaları etiketleyin. Degradenin tepesinden başlayarak 100 veya 200 mikrolitre fraksiyonu toplayın, gradyanın üstüne dikkatlice bir pipet ucu yerleştirin ve tüm gradyan aliquote olana kadar fraksiyonları toplayın. Her fraksiyonun 254 nanometredeki emilimini,% 7 ve% 47 sakkaroz çözeltilerine karşı boşluk olarak bir spektrofotometre ile ölçün.
Kesir sayısını absorbansa karşı çizerek çoklu profili oluşturun. Maya S.Cerevisiae'den üç temsili polizom profili gösterilmiştir. Her ribozomal alt birimin tepesi ve polizom zirvesi her profilde belirgindir.
Otomatik yoğunluk fraksiyonasyon sisteminden temsili bir profil burada gösterilmiştir. Bu profil, sakkaroz gradyanı aşağıdan yukarıya doğru bir kovalama çözeltisi ile, bir dedektör akış hücresi aracılığıyla yer değiştirdiği ve fraksiyonlar halinde toplandığı için sürekli bir absorbans profilinden üretildi. 200 ve 100 mikrolitrelik numunelerin elle parçalanmasıyla oluşturulan polizom profili burada gösterilmiştir.
Bu prosedürle hatırlanması gereken en önemli şey, gradyanları bozmamaktır. Hava kabarcıkları sokmamaya veya çözeltiyi çok hızlı dağıtarak gradyanı bozmamaya dikkat edin. Bu prosedürü takiben, RNA, aktif ribozomlarla ilişkili mRNA'ları belirlemek için daha fazla analiz için gradyanlardan ekstrakte edilebilir.
