Refakatçi-cochaperone etkileşimlerini incelemek için homojen boncuk bazlı bir test yaptık. Bu tekniği kullanarak, Hsp90 ve FKDP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimleri engelleyen küçük molekülleri tarar ve güçlü ve seçici inhibitörleri tanımlarız. Bu yüksek verimli eleme tekniği sağlam ve güvenilirdir.
Sonuçlar bir saat içinde elde edilebilir ve sadece az miktarda boncuk proteini ve bileşikleri gerektirir. Bu cochaperones ile Hsp90 etkileşimi Alzheimer hastalığı, Kanser, Otoimmün hastalık gibi insan hastalıklarına karıştı. Bu teknik, tıbbi önemi yüksek olan refakatçi-cochaperone inhibitörlerini tarama fırsatı sağlar.
İşte bu tahlilin temel prensibi. Hsp90C-Terminal peptid ile cochaperones'un TPR etki alanı arasındaki etkileşim donör ve alıcı boncukları yakınlığa getirdiğinde, oldukça güçlendirilmiş bir sinyal üretilir. Etkileşim inhibitörleri eklendiğinde donör ve alıcı boncuklar yakınlığa ulaşamaz ve tespit edilebilir bir sinyal üretilmez.
PBS'deki Hsp90 peptidi mililitre konsantrasyonunda bir miligramda seyrelterek başlayın. Yargısız kabul eden boncukları PBS'de seyreltin ve boncukları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Seyreltilmiş boncukları yıkamak için santrifüj edin ve ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın.
Konjugat için, kabul eden boncukları peptitler halinde 10'a 1 oranında ayarlayın. PBS seyreltilmiş peptit, Tween 20 ve Sodyum cyanaboroughhydride çözeltislerindeki paletid boncuklarına ve döner çalkalayıcı üzerinde uç ajitasyon ile kuluçkaya yatırın. Reaksiyonsuz bölgeleri engellemek için, boncuklara pH 8.0'ın bir azı dişi Tris hidroklorür çözeltisinin 20 mikrolitresini ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçka yaparak reaksiyonu söndürin.
Kuluçkanın sonunda, boncukları santrifüjleme ile yıkayın ve boncuk peletini bir mililitre Tris hidroklorür çözeltisinde yeniden askıya alın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, boncukları depolama tamponunda mililitre konsantrasyonunda mililitre konsantrasyonunda yeniden askıya alın ve konjuge kabul eden boncuk çözeltisini ışıktan korunan 4 santigrat derecede saklayın.
PBS'de mililitre konsantrasyonu başına 10 mikrogram glutatyon donör boncuk ekleyin. Mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyona GSTFKBP51 ekleyin ve karanlıkta 25 santigrat derecede reaksiyonu 10 dakika kuluçkaya bırakın. DMSO'daki test bileşiği seri seyreltmeleri yapın.
384 kuyu plakasının her kuyusunun köşesine 0,25 mikrolitre test bileşiği seyreltme ve üç taraflı ekleyin. Negatif kontrol için 0,25 mikrolitre DMSO ekleyin ve pozitif kontrol için kuyulara 0,25 mikrolitre Hsp90 C-Terminal peptit ekleyin. Her kuyuya GST etiketli proteinli glutatyon donör boncuk içeren çözeltinin 22,5 mikrolitresini ekleyin.
Tabağı ellerle iyice çalkalayın ve 15 dakika boyunca 25 santigrat derecede karanlıkta kuluçkaya yatırın. Kabul eden boncukları ekli Hsp90C-Terminal peptit ile mililitre konsantrasyonu başına 100 mikrogram PBS'de seyreltin. Her kuyuya 2,25 mikrolitre seyreltilmiş kabul edici boncuk ekleyin.
Plakayı gösterildiği gibi 15 dakika boyunca karanlıkta çalkalayın ve kuluçkaya bırakın. Plaka okuyucu aletini açın, plakanın sinyalini ölçün ve metin el yazmasında açıklandığı gibi verileri analiz edin. Karşılama iletişim kutusunda bir X-Y veri tablosu oluşturun, X numaraları, Y'yi seçin ve yan yana sütunlara üç çoğaltma değeri girin.
Konsantrasyon değerlerini X sütununa ve sinyal değerlerini Y sütununa içe aktarın. Çözümle'yi tıklatın, X konsantrasyonunu dönüştür'ü seçin ve logaritmalara dönüştür'ü seçin. Analiz et'i tıklatın ve X-Y analizi altında doğrusal olmayan regresyon seçin.
Doz yanıt inhibisyonu seçeneğini açın ve log ile yanıt değişken eğim denklemini seçin. IC50 değeri ve grafikleri içeren sonuçları görüntülemek için Tamam'ı tıklatın. Bu test, küçük moleküllerin taranmasında, Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimlerin engellenmesi için kullanılmıştır.
0,8'den fazla Z puanı ve 13,35'lik sinyalden arka plan oranına, yüksek verim taraması için sağlamlığı ve güvenilirliği gösterir. Küçük moleküler ağırlık testi bileşiği D10'un refakatçi-cochaperone etkileşimlerinin inhibisyonu üzerindeki etkisi değerlendirildi ve D10'un doza bağımlı inhibisyon gösterdiği IC50 değerleri hesaplandı. Hsp90 GSTFKBP51 etkileşimleri için IC50 değeri 65 nanomolar idi.
Hsp90, GSTFKBP52 etkileşimleri için ise en yüksek bileşik konsantrasyon ile tam inhibisyon sağlanamazken, protein-protein etkileşiminin küçük moleküllerle seçici inhibisyonunun sağlanabileceğini göstermektedir. Kritik adım ekleme sırasıdır. İlk önce küçük bir molekül ile TPR hedefi arasında bir kompleks oluşturuyoruz.
Aksi takdirde daha uzun inkübasyon ve daha yüksek bileşik konsantrasyonlar gereklidir. Bu tekniği, Hsp90 ve FKB51 veya Hsp90 ve FKB52 arasındaki etkileşimi bozan küçük molekülleri taramak için kullanabiliriz. Ayrıca Hsp90, Hsp70 ve cochaperone tarama seçici inhibitörleri içeren bir TPR motifi arasındaki herhangi bir etkileşime de genişletilebilir.
