Numune aşamasının eğilmesi, tek parçacıklı kriyo-EM veri toplama sırasında parçacıkların oryantasyon dağılımını arttırmanın basit ve genelleştirilebilir bir yolunu sağlar. Numune aşamasının eğilmesi nedeniyle elde edilen parçacıkların eşit dağılımı, genel harita kalitesinin ve yorumlanabilirliğinin iyileştirilmesini sağlar. Numunenin paralel aydınlatılmasını sağlamak ve koma anormalliklerini en aza indirmek için mikroskobu hizalayarak başlayın.
Veri toplamaya uygun kareleri belirlemek için, genel ızgara kalitesine genel bir bakış ve veri toplama için uygun alanların ilk göstergesini sağlayan sahne alanı eğimi olmadan veya sahne alanı eğimi ile bir ızgara atlası kaydedin. Kare toplama düğümünde kullanılan büyütmede kareleri manuel olarak inceleyin. Folyo bozulmamış, susuz görünmediği ve ideal buz kalınlığına sahip olduğu kareleri arayın ve numune aşamasını ilgi çekici bir kareye taşıyın.
Yaklaşık 15 derecelik sahne eğiminde bir alfa yalpalayıcı kullanarak sahne konumu için ösentrik yüksekliği belirleyin ve mikroskop için tuş takımı panelini kullanarak sahneyi ösentrik yüksekliğe getirmek için Z yüksekliğini ayarlayın. Alfa yalpalama rutini sırasında görüntü kaymasının minimum düzeyde olduğundan emin olun. Daha doğru bir Z yüksekliği bulmak için, kare toplama düğümünde kullanılan büyütmedeki odak düğümünde tahmin edin.
Netleme düğümü için ayarları yapın ve karelerin ilk sıraya alınması sırasında ince Z netleme seçeneğini etkinleştirin veya devre dışı bırakın. Ardından Simüle Et'e basın. Gerçek ösentrik yükseklikte veri toplamak için numune aşamasını istenen eğim açısına eğin ve gerekirse sahneyi yeniden ortalayın.
Tüm edinme düğümü pozlamaları için hedefleri sıraya almaya başlamak üzere kare alma düğümünde simüle et düğmesine basın. Ardından, bir Z odak hedefi ve yüksek büyütme pozlamaları için uygun deliklere sahip bölgeler seçin ve hedefleri görüntüleme için kuyruğa gönderin. Örnek aşamasını eğilmemiş durumuna geri getirin ve ardından bir sonraki kareye geçin.
Yeterli sayıda tam pozlama sıraya alınana kadar bu adımları tekrarlayın. Tüm kareler sıraya alındıktan sonra, tüm hedefleme düğümüne gidin ve Sıraya Alınmış Hedefleri Gönder'e basın. Düğüm ayarlarında seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver'i seçin ve otomatik EM delik bulucunun numune aşaması eğildiğinde görüntü alımı için uygun bölgeleri doğru bir şekilde tanımlayıp tanımlayamadığını test etmek için yüksek büyütmeli pozlama toplama düğümü tarafından seçilen hedefleri manuel olarak inceleyin.
Kullanıcı hedefleme doğruluğundan memnun kaldıktan sonra, otomatik veri toplama için Seçilen hedeflerin kullanıcı tarafından doğrulanmasına izin ver seçeneğinin işaretini kaldırın. Izgaranın ösentrik Z yüksekliğine yakın ve uzak toplanan farklı eğim açılarına sahip kare büyütmedeki temsili görüntüleri burada gösterilmektedir. Kirişin merkezi, kırmızı eşmerkezli halkaların merkezi ile gösterilir ve yeşil ok, ilgilenilen kareyi gösterir.
Referans için ilgi karesine bitişik kırık bir ızgara özelliği vardır. Burada, 0 derece, 30 derece ve 60 derece eğim açılarında toplanan temsili delik pozlamaları ve 2B sınıf ortalamaları gösterilmektedir. Protein konsantrasyonu farklı eğim açıları boyunca değişmemiş olsa da, daha yüksek bir eğim açısı, görüntülenen alanın parçacık konsantrasyonu açısından daha kalabalık görünmesini sağlar.
Aşırı kalabalıktan etkilenen 2B sınıf ortalamaları bu kırmızı kutuda gösterilir. Protokolün basitliği, mikroskobun herhangi bir standart kullanıcısının eğimli bir veri toplama stratejisini kolayca uyarlamasını sağlar.
