Bu videoda, iletilen ışık mikroskopisi tekniklerini kullanarak model mantarı aspergillus nidulans'ın görüntülerini yakalamak için etiketsiz canlı görüntüleme protokolünü açıklıyoruz. Bu görüntüleri hem sıvı hem de katı ortamda aspergillus nidulanların büyüme kinetiğini analiz etmek ve ölçmek için kullanıyoruz. Bu protokolün görsel gösterimi, kullanıcıların önemli görüntü yakalama ve mikroskopi görüntü işleme adımları hakkında bilgi sahibi olmalarını sağlar.
Filamentli mantar büyümesini ölçmek için kullanılan yaygın bir yöntem, besin agarı içeren bir Petri kabındaki iki aşılanmış mantar sporudur ve birkaç gün sonra gelişmekte olan koloninin çapını ölçmektir. Ancak, bu yaklaşım ince büyüme farklılıklarını ölçecek kadar hassas değildir. Bu nedenle zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak tek hücreli ölçümler geliştirilmiştir.
Bu ölçümler sadece doğru ve nicel sonuçlar sağlamakla kalmaz, aynı zamanda bir popülasyondaki farklı hücrelerin büyüme dinamiklerini de yansıtabilir. Ayrıca, bu yaklaşım endojen ve çevresel sinyallere mantar büyüme yanıtlarında yer alan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını amaçlamaktadır. Petri tabaklarına 15 mililitre sıvı besin agarı dökerek başlayın.
Kapağı üstüne yerleştirin ve soğumasını bekleyin. Plakaları sterilize etmek için UV radyasyon kullanın. Bir stoktan ilgi mantar suşunu çıkarmadan önce, Bunsen brülöründeki dalgalı halkayı kırmızı sıcak olana kadar ısıtın, halkayı ağar içine bıçaklayarak soğutun.
Tüpü girdaplayın ve uygun beslenme gereksinimleri ile desteklenmiş agar minimal ortamının yüzeyinde döngüyü çizgilendirin. Plakaları 37 santigrat derecede iki ila üç gün kuluçkaya yatır. Steril bir kürdan kullanarak, tek bir koloniye hafifçe dokunarak az sayıda konidiayı tam ortam plakalarına aktarın.
Plakaları 37 santigrat derecede üç ila dört gün kuluçkaya yatır. Aspergillus nidulans conidia, steril 1.5 mililitre girdap tüpünde toplanır, hacim başına% 0.05 hacim içeren 1.0 mililitre otoklav damıtılmış su ile, konidia kümelerinin sayısını azaltmak için 80. Agar orta yüzeyinde filamentli mantarların görüntülenmesi için ters agar yönteminin değiştirilmiş bir versiyonu kullanılır.
Başlangıçta 10 mikrolitre aliquots kuvvetli girdap konidial süspansiyon, yaklaşık iki kez 104 hücre mililitre başına Petri tabaklar üzerinde 15 mililitre minimal orta hacimli bir ağırlık ile hacim agar. Deney kültürünü araştırılacak gelişim evresine göre kuluçkaya yatırın. Burada 30 santigrat derecede üç gün kuluçkaya yatırıyoruz.
Daha sonra, steril bir neşter kullanarak koloniyi içeren bir agar bloğunu dilimleyin. Burada koloni kenar boşluğunda bir agar kamasını kesiyoruz, ters çevirip agar dilimini sekiz, iyi bir kaydırağa yerleştiriyoruz. 200 mikrolitre minimal ortam içeren bir kuyu kaydırağı kuyularında yaklaşık iki kez 10'un gücünde 10 mikrolitrelik niquots kuvvetli girdap konidial süspansiyonu uygun takviyelerle aktarın.
Her seferinde incelenecek zaman ve sıcaklık için kuluçkaya yatırın. Mikroskop seçimi mevcut ekipmana bağlıdır. Her durumda, mikroskop kurulumu ters bir aşama, bir çevre odası veya en azından hassas hava sıcaklığı kontrolüne sahip bir oda içermelidir.
Başlangıçta istenen sıcaklığı stabilize etmek için termostat ve mikroskop odasını önceden ısıtın. Burada sıcaklığı 30 santigrat derece olarak belirledik. Mikroskobu, tarayıcı gücünü, lazer gücünü ve bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını yükleyin.
Önceden hazırlanmış iyi kaydırağı mikroskop aşamasına yerleştirin ve odaklanın. Görüntü analizi sırasında büyüme ölçümlerini kolaylaştırmak için yalıtılmış, örtüşmeyen veya en azından aşırı kalabalık olmayan görünüm alanları bulun. Kullanılacak iletilen ışık mikroskopi tekniğini seçin ve gerektiğinde floresan için dedektörlerin yanı sıra iletilen ışık dedektörünü de etkinleştirin.
Mikroskobu, istenen zaman aralıklarında görüntü elde etmek ve zaman serisi alımını başlatmak için ayarlayın. Görüntülerin yüklenmesi, görselleştirilmesi ve işlenmesi açık kaynaklı imageJ Fiji yazılımı ile gerçekleştirilir. Görüntüleri bir formata göre eklentiler kullanarak Fiji'ye içe aktararak başlayın.
Varsayılan renk modunu ve otomatik ölçeği seçin. Bir zaman damgasını ve ölçek çubuğunu yer paylaşımı olarak görselleştirmek için analize, araçlara, ölçek çubuğuna gidin. Ölçek çubuğunun genişliği, yüksekliği, rengi ve konumuyla ilgili istediğiniz parametreleri ayarlayın.
ImageJ Fiji yazılımında görüntü özelliklerini görüntülemek için görüntüye, özelliklere gidin. Çerçeve aralığı bilgilerini gözlemleyin. Burada yaklaşık 15 dakikalık bir zaman aralığı kullanıyoruz ve tamam tuşuna basıyoruz.
Ardından görüntüye, yığınlara, etikete gidin ve doğru bilgileri aralığa ayarlayın. X ve Y'yi değiştirerek etiketin konumunu ayarlayın.Alan metninde ölçü birimini ayarlayın ve önizlemeye basın. Görüntü, ayarlama, ağartma düzeltme, histogram eşleştirmeyi seçerek farklı kareler arasındaki aydınlatma düzeltmesi için histogram eşleştirmeyi kullanın.
Düzeltilmiş aydınlatmalı yeni bir pencere görüntülenir. Büyüyen hiphal ipucunu izlemek için eklentilerde MtrackJ eklentisini kullanın Parçayı eklemek için araç çubuğunda ekle düğmesini seçin ve farenin sol tıklamasını kullanarak ilk noktayı hipnoz ucuna yerleştirin. Zaman serisi otomatik olarak bir sonraki kareye taşınır.
İzleme işlemini tamamlamak için, son noktada fareyi çift tıklatın veya kaçış tuşuna basın. Hipnoz ucu büyümesini hesaplamak için en önemli sütun olan çıktı tablosunu kaydırmak, herhangi bir çerçevedeki hızdır. Ölçümleri güvenli bir şekilde izleyin, dosya ekleyin, istediğiniz dosya biçimine kaydedin, örneğin CSV, kaydedilen dosyayı elektronik tablo programınıza alın ve görselleştirmeyi ve diğer testleri hesapleyin.
Herhangi bir standart multimedya oynatıcıda görselleştirilebilen, içine parça çizilmiş kareleri içeren bir film, RGB renk türü oluşturmak için film düğmesine basın. Bu protokolün ardından filamentli mantar aspergillus nidulans'ın farklı büyüme ve gelişim evrelerine karşılık gelen çeşitli görüntüler yakaladık ve analiz ettik. Şekil, vahşi tip ve azhAD Delta ngnA Delta büyüme hızı ölçümlerinin karşılaştırmasını göstermektedir.
AzhAD Delta ngnA Delta, iki karboksilik aside ek olarak toksik savaşçı ürün L'nin detoksifikasyonu ve asimilasyonunda yer alan iki gende çift silinmiş bir suşdur. Batık sıvı kültürlerindeki vahşi tip suşuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı daha düşük büyüme hızı ölçümleri göstermektedir. Büyümedeki bu fark, bu iki suşun koloni alanının katı minimal ortamda ölçülmesi ile tespit edilemez.
Tek hücreli, uzun süreli canlı görüntüleme, hücresel protein dinamiklerinin spasiyal ve zamansal bilgilerini elde etme çabasında önemli bir değere sahip. Bu protokol, uzun süreli canlı hücre görüntülemesi yapmak için de uygundur. Burada GFP etiketli çekirdek eisosomal protein PilA ve mRFP histonen H1'i birlikte ifade eden konidia çimlenmesini görüyoruz. Burada, mantar büyüme kinetiğinin kullanıcıdan önceden herhangi bir görüntü analizi deneyimine gerek kalmadan tekrarlanabilir ve güvenilir bir şekilde analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.
Bu protokol, mantar büyümesinin objektif olarak doğru ölçülmesini sağlar.
