Biz onların teknik yardım Brandon Hassett ve Carlos Ortiz teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Dr Michael Kolomiets için NSF hibe İOK-0544428, IOS-0951272, ve IOS-0925561 tarafından desteklenen edildi ve Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü (NIFA), AFRI Bitki Yetiştirme ve Eğitim Bursu # 2.010-85.117 tarafından -20.539 DRS. Seth Murray, Thomas Isakeit ve Michael Kolomiets.

1. Mısırda Çekirdek Biyoassay <ol><li> İki hafta önce, kültür 28. Patates Dekstroz Agar (PDA) üzerinde fungal patojenlere ° C </li><li> Onlar biyoassay şişeleri alt hizasına, ve 50 ml falcon tüpleri yer yatıyordu nedenle tercihen yassı, benzer büyüklüğü ve şekli ile çekirdekler seçin. Seçilen çekirdeklerde benzer tohum yaşı ve metaboliti kompozisyonu sağlamak için aynı ortamda aynı anda yapılmış olmalı. </li><li> 6% sodyum hipoklorit ile% 70 etanol, steril su ile 1 dakika ile 10 dakika ile 5 dakika için oda sıcaklığında tüpler çalkalayarak çekirdekler sterilize yüzey. Devam sallayarak ise steril su ile, her zaman 5 dakika, üç kez yıkayın. Otoklavlanmış havlu kuru Pat çekirdekler. </li><li> Aspergillus flavus enfeksiyonu kolaylaştırmak için, 0.5 cm derinlikteki 18 G iğne ile embriyo-tarafında küçük bir yara oluşturur. Ancak, deneyimlerimiz daha büyük bir yara verticillioides Fusarium enfeksiyonu için gereklidir. Therefore, 0.5 mm derinlikte embriyo tarafı oyulmuş bir tıraş bıçağı kullanın. </li><li> Sporlar kurtarmak ve otoklavlanmış tülbentten en az 4 kat üzerinden filtreleme yerçekimi tarafından misel kaldırmak için otoklavlanmış% 0.01 Tween-20 çözümü yaklaşık 5 ml kültür plakaları sıyırarak inokulum süspansiyon hazırlayın. Hemositometre ile spor konsantrasyonu hesaplayın ve 10 6 spor / A. ml uyum flavus veya F. verticillioides. Diğer türler patojen veya ana bilgisayar kullanıyorsanız, uygun enfeksiyon için inokulum konsantrasyonunun değerlendirilmesi önemlidir. </li><li> Kağıt havlu beş yaprak ve steril 100 ml su ile kaplı bir plastik kap (29.2 cm X 18.7 cm X 8.3 cm) bir nem odası oluşturun. Odası değil su veya hava geçirmez ve ilave su kağıt havlular nemli tutmak için deney boyunca ilave edilmelidir. </li><li> Yeri dört bir otoklavlanmış 20 ml cam sintilasyon şişeye çekirdekleri ve bunların kitle kaydedin. , 200 ul spor süspansiyonu ile inokülekap ve süspansiyon ile eşit kat çekirdeklerinde girdap. Serbestçe nem odasına hava değişimi ve yer sağlamak için kapakları gevşetin. </li></ol> Not: tohumlar ya da bu yöntemler de tarif edilenden başka mantarlar için, inokulum gerekli miktarını farklı olabilir ve deneysel olarak elde edilmelidir. <ol start="8"><li> ° C&#39;de 7 gün boyunca 28 ya da arzu edilen kadar bir 12-h-light/12-h-dark ışık periyodu altında çekirdekler inkübe. </li></ol> 2. Konidyumların Enumeration <ol><li> Enfeksiyon döneminden sonra, 1 dakika boyunca iyice enfekte çekirdekleri ve vorteks içeren sintilasyon şişelere otoklavlanmış% 0.01 Tween-20 5 ml ekleyin. </li><li> Geniş çaplı bir pipet kullanarak, hemen% 0.01 Tween-20 (veya enfeksiyon bağlı olarak gerektiği gibi sulandırmak) 1.8 ml içeren 2.0 ml Eppendorf tüplere spor süspansiyon iki ayrı 200 ul hacimde transfer ederek sulandırın. </li><li> Bir hemositometre 4 ile iki kez 200 ul tablet numaralandırve tedaviler arasında Konidyumların düzeylerini karşılaştırmaktır. </li></ol> 3. Aflatoksin Niceleme <ol><li> % 80 metanol ve 0.05 g NaCl, 1 dakika süreyle yüksek bir hızda kapak ve karışım 20 ml ile 1 numuneden 50 ml blender kabına çekirdekler ekleyin. </li><li> Temiz bir koleksiyon geminin üzerinde bir oluklu filtre kağıdı yerleştirin ve filtre içine özü dökün. </li><li> Temiz bir gemiye süzüntü 10 ml transfer, 20 ml saf H 2 O ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Temiz bir kap içine bir 1.5 mikron cam mikro filtre ile filtre örneği. </li><li> Afla Testi kolonuna süzüldü ekstresinin 1 ml uygulamak ve sıkıştırılmış hava kullanarak, boşaltılır kadar 1-2 damlası / saniye arasında bir oranda kolonundan süzüldü özü zorlar. </li><li> Distile H 2 O 1 ml ile iki kez sütun yıkayın ve damla / saniye hava yoluyla gelene kadar 1-2 de sütun geçer. </li><li> Damla / bir cam küvet içinde toplanan ikinci sınıf bir anda 1-2 1ml 100% HPLC saflıkta metanol ile Zehir sütun. </li><li> Eklemek1 eluat için Afla Testi Geliştirici ml ve iyice karıştırın. Yer kalibre florimetre içine küvet ve 60 sn okuyun. </li></ol> Not: Aflatest FGIS protokolünün kullanıldığı zaman, gelen florimetre ölçümü 100 ml ekstre numunenin bir ilk 50 gram dayanarak hesaplanır. Eğer su ile seyreltme örneğin göz önüne alınırsa, 1 ml numunesinin 0,166 gram temsil eden bir kolonuna tatbik edildi. Yani, protokol değiştirirken, hesap içine örneklem büyüklüğü farklılıkları ve ilk ekstraksiyon çözeltisi almak gerekir. Örneğin, çekirdeklerin 2 gram 20 ml% 80 metanol içinde ekstre edilir. Bu, 0.1 gr / ml &#39;dir. Bu örnek 1 ml 2 ml su ile karıştırılmış olduğu zaman, sıvı numune oranı artık 0,033 gram / ml &#39;dir. Bu örnek 100 ppb arasında bir florimetre okuma verirse, gerçek konsantrasyon, ppb = (0,166 gram X 100 ppb) / 0.1 gram), ya da 166 ppb olan 0,166 için numune oranı, dayanmaktadır. Alternatif aflatoksin Niceleyici içinkatyon yöntemleri, kaynak 7 bakın. 4. Fumonisin B1 (FB1) Analizi <ol><li> Mantar misiri yetiştirilen edildiğinde, agitasyon olmadan, oda sıcaklığında asetonitril / su (50/50, v / v) 10 ml bir gece boyunca örnekleri özü. Daha sonra, deiyonize su (6 ml) ile özü (2 ml) bir karışımı, ve C-18 katı faz çıkarımı ile doğrudan (8 ml) bir karışımı, bu geçerlidir. </li><li> Örnek yüklemeden önce, şart 2 ml su, ardından 2 ml asetonitril ile durulanması ile C-18 sütunu katı faz ekstraksiyonu. </li><li> Örnek yerleştirilmesinden sonra, kolon Asetonitril / su (15/85, v / v) ve 2 ml ardından 2 ml su ile yıkanır. HPLC analizi (FB1 içeren) için örnek asetonitril / su (70/30, v / v) 2 ml ile elüt edilmektedir. </li><li> 0.1 ml borat tamponu (0.05 M borik acid/0.05 M sodyum borat [50/50, v / v], pH 8.5) ve 0,1 ihtiva eden bir şişeye kolon eluat, 0.1 ml aktararak o-phthaldehyde (OPA) ile FB1 türevlendirmek ml OPA (aseton içinde 0.1 mg / mlmerkaptoetanol) -% 0.5 &#39;i ile itrile. </li><li> Acetonitrile/0.01 M borik asit (40/60, v / v) ile 0.5 ml ilave edilerek 10 dk sonra reaksiyon durdur. </li><li> Analitik bir Zorbax ODS kolon (4.6 150 mm) ve Değişken dalga boylu Shimatzu RF-10Axl floresans dedektör (eksitasyon 335 nm / 440 nm emisyon) ile donatılmış bir Shimadzu HPLC LC-20AT sisteminde FB1 analiz edin. </li><li> A lineer gradyan kullanılır (çözücü A: acetonitrile/0.1 M sodyum fosfat (40/60), pH 3.3; çözücü B: asetonitril / 0.1 M sodyum fosfat (60/40), pH 3.3) olup aşağıdaki gibidir ve gradyan programı: % 100 A 5 dakika süre ile 10 dak,% 100 B,% 100 B. </li><li> HPLC ile analiz FB1 standartlarına ve pik alanı ölçümleri standart eğri oluşturmak için kullanılır. Daha sonra, FB1 standart eğri ile pik alanları karşılaştırılarak bir örnek FB1 seviyesini ölçmek. </li></ol> 5.. Ergosterol Analizi <ol><li> 7-14 gün için mısır taneleri Kültür mantarı. </li><li> Met: inkübasyon süresinden sonra, kloroform ile 10 ml ilaveHer şişe içinde anol (02:01, hac / hac). Bir kez eklendi, ve numuneler çalkalanır ve daha sonra 24 saat için oda sıcaklığında karanlıkta şişeleri inkübe edilir. </li><li> 24 saat sonra, numuneler santrifüj edilir ve süpernatan toplamak ve 0.45 um Naylon zar filtresinden. </li><li> Doğrudan 4.6 U ODS-C18 kolon (200 Å, 250 ± 4.6 mm) ve Shimadzu SPD-20A / UV 282 nm de izlemek için ayarlanmış VIS detektör ile donatılmış bir Shimadzu HPLC LC-20AT sisteme örnek enjekte. </li><li> 1.5 ml / min mobil faz olarak bir akış hızında metanol (% 100) kullanılır. HPLC dereceli ergosterol üretilen standart eğrisine örneklerin pik alanları karşılaştırılarak örneklerinde ergosterol miktar belirleyin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Iki üç gün için bir nem odası, aşılama ve inkübasyon ardından, mantar üremesi çekirdekleri görünmeye başlaması gerekir. Yedi gün tedavi sonrası, tedavi edilen bitkiler üzerinde vejetatif büyümeyi, whil açıkça görünür olmalıdıre sahte denetimleri (Şekil 1B, üst) bulaşmamış olmalıdır. Uzun kuluçka dönemleri daha bol bitki büyümesi (Şekil 1B, alt) için elverişli. Koşullar altında burada tarif (Şekil 2G), A. flavus vahşi tip NRRL sırasıyla 8, 6, ve 8 gün, az kolonizasyon, aflatoksin birikimi ve Konidyumların üretim 3357 görüntülenen maksimum değerleri (Şekil 2, AC). Ancak, mikotoksin kontaminasyonu ve conidiation ergosterol birim kıyaslandığında, yüksek seviyelerde (Şekil 2, DE) sırasıyla 4 ve 6 gün gözlendi. Şekil 2F bu mantar biyokütle bağımlı maksimum değer gözlemler özetlemektedir. İlginçtir, 4-6 gün sonrası aşılama arasında, çekirdekler gibi zaman ders (Şekil 2H, alt) örneklerinden total RNA tarafından görülen nükleik asit yıkımı, uğrarlar. Kendi de dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar, postmena vared F. verticilliodies mısırdan çekirdekleri 2,8,9,10,11,12 üzerinde enfeksiyon ve başarıyla zaman noktaları gözlemler gibi 7-13 gün kullanılır. Yöntemleri kullanarak burada anlatılan, 3,500-8,000 ng / g çekirdek 4,13 ve ergosterol seviyeleri gelen fumonisin seviyeleri fumonisin (üstte) ve ergosterol (alt için 5.000-10.000 gelen ng / g çekirdek 14,13. Şekil 3 temsilcisi zirveleri ) HPLC kromatogramları gelen. Ergosterol ölçüm da absorbans spektrumları 15 aracılığıyla gerçekleştirilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Şekil 1. Fungal biyokütle, sporogenesis ve mikotoksin üretimi ve çekirdek biyoanalizlerin gelen vejetatif büyüme temsilcisi sonuçlarının ölçülmesi için akış çizelgesi. Mısırdan çekirdeklerde fungal patogenezi değerlendirmek için kullanılan temel biyolojik parametreleri ölçümü için açıklanan yönteme özetleyen A) akış çizelgesi. B) Temsilcisiçekirdek biyoanalizlerin için sonuçlar. Top, A. flavus (NRRL3357) B73 genetik arka planda mısırdan çekirdeklerde vejetatif büyümeyi. Tohumlar 10 6 spor / ml ve resimlerin 200 ul 7 gün sonrası aşılama çekildi ekildi. Alt, F. verticillioides B73 plan 13 gün sonrası enfeksiyon çekirdekler aşılandı. Çekirdekler 10 6 sporların / mL &#39;lik 200 ul ile inoküle edildi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Şekil 2. Aspergillus flavus çekirdek biyoassay zaman tabii. B73 çekirdekler 10 6 sporların / ml Aspergillus flavus konidial süspansiyonun 200 ul ile aşılandı ve 2-8 gün (G) inkübe edildi. (Ortalama ± SE n = 3-4) tüm değerler 4 çekirdeklerin kuru ağırlığının ortalama belirlenmiştir. A) Colonization (ergosterol dayalı), (B) aflatoksin, ve (C) conidiation yukarıda açıklanan yöntemler kullanılarak ölçüldü. E) Aflatoksin ve (F) conidiation gösterilirh ergosterol vasıtasıyla ölçülmüş olarak fungal biyokütle bir fonksiyonu olarak. F) ergosterol, aflatoksin birikimi ve fungal biyokütle bir fonksiyonu olarak conidiation için maksimum değerler - her türlü miktar için maksimum değerleri% 100 olarak gözlendi. Zaman dersten toplam RNA kulvar için (H) 1 mg. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Şekil 3. Fumonisin B1 (üstte) ve Fusarium verticillioides (M3125) ile enfekte çekirdekleri izole ergosterol (alt) Temsilcisi Yüksek Performans Sıvı Kromatografi (HPLC) kromatogramları.

<ol>
	<li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals.">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li><li>Gao, X., Shim, W. -. B., G&#246;bel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin.">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li><li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem.">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li><li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., G&#246;bel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp.">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li><li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi.">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li><li>Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels.">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li><li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins.">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li><li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia.">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li><li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids.">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li><li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusarium+verticillioides+GAP!,+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein,+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence.">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li><li>Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides.">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li><li>Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+(C-type)+gene,+FCC1.">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li><li>Christensen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li><li>Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+PPR1+and+PPR2,+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides.">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119 (2009).</li><li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast.">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Ben ifşa hiçbir şey yok.</p

<p class="jove_content"&gt; Burada anlatılan yöntemler kapsamlı test ve fungal kolonizasyon, sporogenesis ve mikotoksin üretimi için ölçülebilir sonuçlar nesil sağlam olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, bu yöntemler mycotoxigenic mantarların (örn. yer fıstığı, buğday, pamuk, fıstık vb) ile kontaminasyon duyarlı olan diğer bitki türlerinin tohumları için geçerli olmalıdır. Yetkili bitki-patojen etkileşimi analizleri için, tohumların yaşatılması şarttır. Tohum canlılığını korurken çekirdeğin embriyo tar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> # Kataloğa </td></tr><tr><td> Patates Dekstroz Agar </td><td> Fisher Scientifc </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Scientifc </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Plastik inkübasyon konteyner </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Karıştırıcı </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 cm Yivli Filtre Kağıtları </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1.5 mikron cam mikrofiber </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla Testi sütununda </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla Testi Geliştirici </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Asetonitril </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 katı faz ekstraksiyon kolon (Hazırlık Eylül SPE C18 Sütun) </td><td> Fisher Scientifc </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-fitalaldehit (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> 79.760-5g </td></tr><tr><td> Asit borik </td><td> Fisher Scientifc </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Sodyum borat </td><td> Fisher Scientifc </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Merkaptoetanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (Pompa) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax ODS kolon (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl floresans dedektör </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Sodyum fosfat </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 standartları </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Kloroform </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 0,45 um Naylon zar (HPLC) ile 13 mm şırınga filtresi </td><td> Pall Hayat Bilgisi </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45.480-50G-F </td></tr><tr><td> Sintilasyon şişeleri </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

quantification of fungal colonization, sporogenesis, and production of mycotoxins using kernel bioassays

Tarafından tahıl çürüyen tohum bulaşmasını mantarların insan ve hayvan sağlığı için ciddi riskler söz değil, tahıl üretimini dünya çapında büyük ekonomik mücadelelerinden birisidir. Tahıl üretimi arasında, mısırın tahıl bütünlüğü ve mikotoksin tohum kontaminasyon patojen kaynaklı zararlar nedeniyle, belki de en çok etkilenen üründür. Mısırdan yetiştiricileri ve gıda ve yem işlemciler için iki en yaygın ve sorunlu mikotoksinler sırasıyla Aspergillus flavus ve Fusarium verticillioides tarafından üretilen aflatoksin ve fumonisin, vardır. Moleküler bitki-patojen ilişkileri son yıllarda yapılan çalışmalara mantar enfeksiyonu ve mikotoksin kontaminasyonu 1,2,3,4,5,6 için bitki cevabı ile birlikte özel mekanizmalar anlamada umut göstermiştir. Birçok laboratuvar bitki-patojen ilişkileri incelemek için çekirdek testleri kullandığınızdan, farklı biyolojik parametreleri hesaplamak için bir standart yöntem için bir ihtiyaç, bu nedenle oradaFarklı laboratuvarlarda elde edilen sonuçlar çapraz yorumlanabilir. Tohumlar üzerinde kantitatif analiz için sağlam ve tekrarlanabilir araçlar için, mantar üremesi, biyokütle, ve mikotoksin kirliliği ölçmek için in-lab çekirdek testleri ve sonraki yöntemleri geliştirmişlerdir. Dört sterilize darı çekirdekleri bir fungal süspansiyon (10 6) ile cam şişe içinde aşılanmış ve önceden belirlenmiş bir süre boyunca inkübe edilir. Numune şişeleri daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), bir AflaTest florimetre yöntemi kullanılarak aflatoksin miktar ve HPLC ile fumonisin kantifikasyon tarafından hemositometre, ergosterol tabanlı biyokütle analizi ile Konidyumların sayımı için seçilir.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays at JoVE.com

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K Görüntüleme.  Texas A&M University. Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Video: Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no fitness consequence (commensal), or be beneficial (mutualistic). While much attention has been given to pathogenic interactions, little is known about the processes that dictate the reproducible acquisition of beneficial/commensal bacteria from the environment. The light-organ mutualism between the marine Gram-negative bacterium V. fischeri and the Hawaiian bobtail squid, E. scolopes, represents a highly specific interaction in which one host (E. scolopes) establishes a symbiotic relationship with only one bacterial species (V. fischeri) throughout the course of its lifetime6,7. Bioluminescence produced by V. fischeri during this interaction provides an anti-predatory benefit to E. scolopes during nocturnal activities8,9, while the nutrient-rich host tissue provides V. fischeri with a protected niche10. During each host generation, this relationship is recapitulated, thus representing a predictable process that can be assessed in detail at various stages of symbiotic development. In the laboratory, the juvenile squid hatch aposymbiotically (uncolonized), and, if collected within the first 30-60 minutes and transferred to symbiont-free water, cannot be colonized except by the experimental inoculum6. This interaction thus provides a useful model system in which to assess the individual steps that lead to specific acquisition of a symbiotic microbe from the environment11,12.
Here we describe a method to assess the degree of colonization that occurs when newly hatched aposymbiotic E. scolopes are exposed to (artificial) seawater containing V. fischeri. This simple assay describes inoculation, natural infection, and recovery of the bacterial symbiont from the nascent light organ of E. scolopes. Care is taken to provide a consistent environment for the animals during symbiotic development, especially with regard to water quality and light cues. Methods to characterize the symbiotic population described include (1) measurement of bacterially-derived bioluminescence, and (2) direct colony counting of recovered symbionts.

Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri

The method outlines the procedure by which the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes and its bacterial symbiont, Vibrio fischeri, are raised separately and then introduced to allow for specific colonization of the squid light organ by the bacteria. Colonization detection by bacterially-derived luminescence and by direct colony counting are described.

Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri</em

Specific bacteria are found in association with animal tissue1-5. Such host-bacterial associations (symbioses) can be detrimental (pathogenic), have no ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Fungal Patojen Fagositoz Canlı hücre video Mikroskopi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

B Grubu bir murin modelinde<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vajinal Kolonizasyon

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse models of pulmonary fungal infection. Although multiple methods are used to assess fungal burden, quantitative polymerase chain reaction (qPCR) of fungal DNA has emerged as a technique with several advantages over previous culture-based methods. Currently, a comprehensive assessment of lung pathology, leukocyte recruitment, fungal burden, and gene expression in mice with invasive aspergillosis (IA) necessitates the use of a significant number of experimental and control animals. Here the quantification of lung histological staining to determine fungal burden using a reduced number of animals was examined in detail. Lung sections were stained to identify fungal structures with Gomori&#39;s modified methanamine silver (GMS) staining. Images were taken from the GMS-stained sections from 4 discrete fields of each formalin-fixed paraffin-embedded lung. The GMS stained areas within each image were quantified using an image analysis program, and from this quantification, the mean percentage of stained area was determined for each sample. Using this strategy, eosinophil-deficient mice exhibited decreased fungal burden and disease with caspofungin therapy, while wild-type mice with IA did not improve with caspofungin. Similarly, fungal burden in mice lacking &#947;&#948; T cells were also improved by caspofungin, as measured by qPCR and GMS quantification. GMS quantification is therefore introduced as a method for the determination of relative lung fungal burden that may ultimately reduce the quantity of experimental animals required for comprehensive studies of invasive aspergillosis.

Here we describe a protocol to determine pulmonary fungal burden in mice with invasive aspergillosis by quantification of Gomori&#39;s modified methanamine silver staining in histological sections. Use of this method resulted in comparable results with less animals compared to assessment of fungal burden by quantitative PCR of lung fungal DNA.

Deneysel aspergilloz akciğer mantar yükünü belirlemek için histolojik miktar

The quantification of lung fungal burden is critical for the determination of the relative levels of immune protection and fungal virulence in mouse ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...