We thank Eliq Oster for the images of the Bacillus subtillis. The work is supported by the European Research Council (# 260871) and the Israel Science Foundation (#592/10).

1.. Setup oluşturun <ol><li> Optik çözünürlüğe sahip bir masaüstü Tarayıcı seç: 4.800 dpi; Donanım çözünürlüğü: 4.800 x 9.600 dpi; renk bit derinliği: 48 bit, ilgili sıcaklık ve nem seviyelerinde çalışabilir. </li><li> Petri kapları genellikle ticari tarayıcılarında kullanılan kağıt aksine, önemli bir hacmi var. Koloniler, yaklaşık 5 mm tarayıcı yüzeyi üzerinde, agar tabakasının üstünde yer alır. Not: Çoğu tarayıcılar için koloniler odak noktası olacaktır. </li><li> Bazı tarayıcı şirketler aynı bilgisayara aynı türden tarayıcı birden fazla örneğinin bağlantısına izin vermez. Birden fazla tarayıcı bağlı ve benzersiz tespit edilebilir emin olun. </li><li> Aşağıda ayrıntılı olarak aksesuarları hazırlayın: <ol><li> Steril siyah hazırlayın adet plakaları kapsayacak bez (Şekil 1 adım 2) hissettim. </li><li> Yerinde Petri yemekleri tutmak için, tarayıcılar uygun beyaz plaka sahipleri (Gereç ve Yöntem) hazırlamak ve 6 hol vares yemekleri boyutu (Şekil 1 adım 3). </li></ol></li><li> Mikroorganizmanın büyümesi için gerekli ise, sıcaklık kontrollü bir ortamda tarayıcılar koydu. Bilgisayara tarayıcılar bağlayın. </li><li> İsteğe bağlı: bilgisayara rölesini bağlayın ve sıcaklık gradyanı aşmak için tarayıcının açık / kapalı anahtarını atlamasına. NOT: röle ünitesi son derece ısıya duyarlı mikroorganizmaların içindir. Elektronik dengesiz yüzey ısıtmak yok böylece tarayıcıyı kapatır. Tarayıcı yüzeyinin sadece bir kısmını kullanarak, benzer sonuçlar elde edilebilir. </li></ol> 2.. Tarama Yöneticisi yükleyin <ol><li> Http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications.html bir belirlenen dizine tüm &#39;Tarama Yöneticisi&#39; uygulama dosyalarını kopyalayın. </li><li> Onlar Bilgisayar Yönetimi-&gt; Aygıt Yöneticisi-&gt; Görüntüleme Cihazları (göründükleri gibi tarayıcılar isimlerine göre ScanningManager.exe.config dosyayı yapılandırın <strong&gt; Şekil 2). </li><li> &#39;Tarama Yöneticisi&#39; uygulamasının sorun giderme için, beni oku dosyasını bakın. </li><li> &#39;Tarama Yöneticisi&#39; uygulaması başka evrakların, Documentation.html bakın. </li></ol> 3.. Deneme gerçekleştirin <ol><li> Petri kapları (Şekil 1) hazırlanması: <ol><li> Yaklaşık 2.000 CFU / ml kültür seyreltin. Muntazam plaka yüzeyi üzerinde kültürünün 0.1 ml Plate. </li><li> Sömürgeler ve çanak arasında iyi bir kontrast elde etmek ve nemi absorbe, steril siyah bir parça ile kapak plakası bez hissettim. Plaka üzerinde kapak koymak. </li></ol></li><li> Tarayıcılar üzerinde tutuculara tabak yerleştirin. </li><li> Ekli tarayıcılar listesinden katılan tarayıcılar seçin: Tarama Yöneticisi (Şekil 3) başlatın. (Tekrarlari) alınacak resim sayısını, sonraki görüntüleri arasındaki zaman aralığını (Time boşluk), ve t başlamadan önce gecikme süresini seçino (sonra başlat) deneme. </li></ol> Görüntüler 4. Analizi NOT: hesaplama yöntemleri bir taslak http://www.phys.huji.ac.il/bio_physics/nathalie/publications de ticari olmayan kullanım için serbestçe kullanılabilir &quot;ScanLag&quot; kullanılarak MATLAB görüntüleri analiz sağlanır. html. Mevcut Diğer fonksiyonlar yazılım kılavuzunda ayrıntılı olarak, ve bir örnek kod güçleniyor. <ol><li> Ayrı klasörlere her tarayıcıdaki görüntüleri sıralamak. </li><li> Matlab&#39;ın Komut penceresini kullanarak, aşağıdaki işlemleri çalıştırın. Bu işlemleri çalıştırmak için gereken parametreler yazılım kılavuzuna tanımlanır. <ol><li> Ön işleme gerçekleştirmek için PreparePictures çalıştırın: önişleme olarak, bir tarayıcıdan görüntüleri hizalanır. Her Petri görüntülerin her dizisinden kırpılır. Her resim toplandı hangi zaman damgası alınır. </li><li> E&#39;de algılama ve izleme gerçekleştirmek için çalıştırın TLAllPlatesach Petri ayrı ayrı koloniler tespit ve tanımlama numarası tahsis edilir. </li><li> Ekstre verilerin analizi: Her tespit kolonisinin boyutları, zamanın bir fonksiyonu olarak ölçülür. Kolonilerin görünümü dağılımını ayıklamak için Matlab&#39;ın komut penceresinde aşağıdaki fonksiyonları (daha fazla bilgi yazılım kılavuzunda mevcuttur) kullanın: <ol><li> Zaman (Şekil 4) karşı boyutu kolonilerin grafiği ile birlikte belli bir Petri kabı analizini görüntülemek için ScanLagApp çalıştırın. <ol><li> Plaka şimdiki zaman değiştirmek için kaydırma çubuğunu kullanın. Zamanlama da koloniler alan grafik üzerinde eşleşen bir dikey çizgi ile gösterilir. </li><li> Ilişkili eğrisini görmek için kolonisi üzerinde tıklayın, ve tersi, ilişkili koloni bulmak için bir eğri üzerine tıklayın. Koloniyi belirledikten sonra, fenotip tespit Petri kabı koloni seçerek alınabilir. </li><li> Choo tarafından otomatik analizi filtre kusurlarBir koloni şarkı ve dışlamak butonuna tıklayarak. Koloninin sayısını dışlamak tıklayarak sarıya dönecektir. </li></ol></li><li> Her plaka analiz sonuçlarına geçtikten sonra, sonuçları Özetle: <ol><li> Görünüm kez bir histogram oluşturmak için AddHistograms çalıştırın. </li><li> Dağıtımının bir sağkalım eğrisi gösterimi oluşturmak için plotDeathCurve çalıştırın. </li><li> Deneyde tüm kolonilerin görünümü zaman almak için GetAppearanceTimes çalıştırın. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bochner, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+phenotypic+characterization+of+bacteria.">Global phenotypic characterization of bacteria.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 191-205 (2009).</li><li>Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+of+bacterial+cultures.">The growth of bacterial cultures.</a> Annual Reviews in Microbiology. 3, 371-394 (1949).</li><li>Penfold, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Nature+of+Bacterial+Lag.">On the Nature of Bacterial Lag.</a> J Hyg (Lond. 14, 215-241 (1914).</li><li>Powell, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+and+generation+time+of+bacteria,+with+special+reference+to+continuous+culture.">Growth rate and generation time of bacteria, with special reference to continuous culture.</a> J Gen Microbiol. 15, 492-511 (1956).</li><li>Elfwing, A., LeMarc, Y., Baranyi, J., Ballagi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+growth+and+division+of+large+numbers+of+individual+bacteria+by+image+analysis.">Observing growth and division of large numbers of individual bacteria by image analysis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 675-678 (2004).</li><li>Hertog, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+automated+image+analysis+for+detection+and+phenotyping+of+Mycobacterium+tuberculosis+on+porous+supports+by+monitoring+growing+microcolonies.">Simplified automated image analysis for detection and phenotyping of Mycobacterium tuberculosis on porous supports by monitoring growing microcolonies.</a> PloS one. 5, (2010).</li><li>Levin-Reisman, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+imaging+with+ScanLag+reveals+previously+undetectable+bacterial+growth+phenotypes.">Automated imaging with ScanLag reveals previously undetectable bacterial growth phenotypes.</a> Nature Methods. 7, (2010).</li><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+cells.">Persister cells.</a> Annual review of microbiology. 64, 357-372 (2010).</li><li>Metris, A., George, S. M., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+optical+density+detection+times+to+assess+the+effect+of+acetic+acid+on+single-cell+kinetics.">Use of optical density detection times to assess the effect of acetic acid on single-cell kinetics.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72, 6674-6679 (2006).</li><li>Niven, G. W., Fuks, T., Morton, J. S., Rua, S. A. C. G., Mackey, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+measuring+lag+times+in+division+of+individual+bacterial+cells+using+image+analysis.">A novel method for measuring lag times in division of individual bacterial cells using image analysis.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 311-317 (2006).</li><li>Niven, G. W., Morton, J. S., Fuks, T., Mackey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environmental+stress+on+distributions+of+times+to+first+division+in+Escherichia+coli+populations,+as+determined+by+digital-image+analysis+of+individual+cells.">Influence of environmental stress on distributions of times to first division in Escherichia coli populations, as determined by digital-image analysis of individual cells.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 3757-3763 (2008).</li><li>Pin, C., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+and+population+lag+times+as+a+function+of+cell+age.">Single-cell and population lag times as a function of cell age.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74, 2534-2536 (2008).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+stress+on+individual+lag+time+distributions+of+Listeria+monocytogenes.">Influence of stress on individual lag time distributions of Listeria monocytogenes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 2940-2948 (2005).</li><li>Metris, A., George, S. M., Peck, M. W., Baranyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+turbidity+detection+times+produced+by+single+cell-generated+bacterial+populations.">Distribution of turbidity detection times produced by single cell-generated bacterial populations.</a> Journal of Microbiological Methods. 55, 821-827 (2003).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li><li>Glaser, D. A., Wattenburg, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+system+for+the+growth+and+analysis+of+large+numbers+of+bacterial+colonies+using+an+environmental+chamber+and+a+computer-controlled+flying-spot+scanner.">An automated system for the growth and analysis of large numbers of bacterial colonies using an environmental chamber and a computer-controlled flying-spot scanner.</a> Ann N Y Acad Sci. 139, 243-257 (1966).</li><li>Guillier, L., Pardon, P., Augustin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+bacterial+colony+growth+as+a+tool+to+study+individual+lag+time+distributions+of+immobilized+cells.">Automated image analysis of bacterial colony growth as a tool to study individual lag time distributions of immobilized cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 65, 324-334 (2006).</li><li>Michel, J. B., Yeh, P. J., Chait, R., Moellering, R. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+interactions+modulate+the+potential+for+evolution+of+resistance.">Drug interactions modulate the potential for evolution of resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14918-14923 (2008).</li><li>Ernebjerg, M., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Growth+Strategies+of+Soil+Bacteria+as+Revealed+by+Large-Scale+Colony+Tracking.">Distinct Growth Strategies of Soil Bacteria as Revealed by Large-Scale Colony Tracking.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78, 1345-1352 (2012).</li><li>Rotem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phenotypic+variability+by+a+threshold-based+mechanism+underlies+bacterial+persistence.">Regulation of phenotypic variability by a threshold-based mechanism underlies bacterial persistence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12541-12546 (2010).</li><li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bactericidal+action+of+penicillin+on+staphylococcus+pyogenes.">The bactericidal action of penicillin on staphylococcus pyogenes.</a> Irish Journal of Medical Science. 19, 585-595 (1944).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiol. 13, 25 (2013).</li><li>Moyed, H. S., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hipa+a+Newly+Recognized+Gene+of+Escherichia-Coli+K-12+That+Affects+Frequency+of+Persistence+after+Inhibition+of+Murein+Synthesis.">Hipa a Newly Recognized Gene of Escherichia-Coli K-12 That Affects Frequency of Persistence after Inhibition of Murein Synthesis.</a> Journal of Bacteriology. 155, 768-775 (1983).</li><li>Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence:+mechanisms+for+triggering+and+enhancing+phenotypic+variability.">Persistence: mechanisms for triggering and enhancing phenotypic variability.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 21, 768-775 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Doğrudan gözleme dayalı mikroskobik yöntemler genellikle tek hücre davranışlarını incelemek için &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilmektedir. Bakteri popülasyonlarında lag kez dağılımının ölçümü sağlar ScanLag, tek hücreli analizinden elde edilen dağılımı ile iyi bir uyum içinde veri sağlayan ve daha yüksek bir istatistik sağlar. Birkaç kritik adımlar iyi çalışması için bu yöntem için yapılması gerekir: Birincisi, iyi bir görüntü elde etmek için 4,800 x 9,600 olmalıdır tarayıcı çözünürlük, üzerinde uzlaşma yok. İkincisi, güç yönetimi modülü (adım 1.6) olmadan, sıcaklık gradyanı dorse yüzeyinde gelişebilir ve büyümeyi etkileyebileceğini unutmayın. Diğer önemli bir adım yanlışlıkla yazılım tarafından koloni sayılır olabilir toz gibi kusurların filtrasyon. Yazılımın dahili arka plan çıkarma genellikle bu kusurları üstesinden gelir, ama bazen &quot;yanlış&quot; kolonileri varel ile filtrelenebilir. (A) mikroorganizmaların büyüme hızı sıcaklıktan etkilenir: Ana sorun giderme adımları çeşitli nedenlerden dolayı, kurulum arası plaka değişimi ele alabilir. Farklı sıcaklık ve nem koşulları nedeniyle inkübatör çanak düzensiz havalandırma veya yere oluşabilir. (B) tarayıcının elektronik tarayıcının yüzeyi boyunca bir sıcaklık gradyanı ısınmasına ve neden olabilir. 10 birlikte önce tarayıcı yüzeyi üzerindeki sıcaklık ölçümleri ile, Bacillus bakteriler üzerinde mekansal ısı derecesinde etkisini gösterir ve Şekil güç yönetimi modülü uygulanmasından sonra (1.6 adım). Bu modül yeni tarayıcılar için gerekli olmayabilir, ve tarayıcı yüzeyinin sadece bir bölümü kullanılır ise, güç yönetimi gereksiz olabileceğini unutmayın. (C) agar besin farklı donukluk ile Tabaklar algılama farklı düzeylerde yol açabilir. 11. gösterileri inci Şekilfarklı opasiteler neden besin agar farklı hacimlerde e tolerans. Deneysel ScanLag tekniği gerçekleştirmek kolaydır ve sadece standart Petri yemekleri mikroorganizmaları plaka ve tarayıcının bir yüzeye koyun gerektirir. Geliştirilen yazılım tüm prosedürü kontrol eder. Görüntü elde etme otomatik olarak yapılır ve koloni izleme için görüntü analizi de otomatik olur. Ayrıca, sistem ölçekli kadar olabilir, aynı zamanda bir çok farklı koşullar ölçmek için. Son olarak, bu yöntem, ticari ofis tarayıcılar dayanır ve bu nedenle, düşük maliyetli. Bu teknik, E&#39;den farklı mikroorganizmaların çalışma uzatılabilir E. coli K-12, ancak bazı noktalar yapılması gerekir. İlk olarak, daha sonra olanlar erken görünen kolonilerin etkisi önceki bir yayında 7&#39;de ayrıntılı olarak tarif edildiği gibi, değerlendirilmelidir. E. Coli K-12,plaka başına CFU maksimum yoğunluğu. kolonilerin farklı boyutlarda olan diğer suşlar 200 ve koloniler arasındaki diğer muhtemel çapraz talk, farklı bir yoğunluk gerektirebilir. İkinci olarak, plakaların analiz katı, orta ve koloniler arasındaki kontrast bağlı olarak, modifiye edilmesi gerekebilir özel yazılım tabanlı bir eşik için kalibre edilir. Yazılım lag ve büyüme oranı ötesinde diğer koloni özelliklerini elde etmek için de uzatılabilir. Yazılım kodu açıktır ve koloni şekli, parlaklık, yumuşaklık ve renk elde etmek için modifiye edilebilir. Ölçümleri tek hücrelerden köken kolonileri üzerinde yapılmış olduğundan, verileri nüfus seviyesi ölçümlerine göre edilemeyen yeni fenotipleri ortaya koymaktadır. Gecikme süresi dağılımının önemi antibiyotiklerin varlığında ortaya çıkar. Birçok antibiyotikler sadece artan hücrelerine karşı etkili olduğu bilinmektedir; Bu nedenle sürece hücreler gecikme aşamasında kalır ve büyümek değil, onlar proBu antibiyotik 21 etkilerinden koruma altında. Kalanlar bakterilerin sayıları antibiyotik tedavisi 15,22,23 sırasında zaman aralıklarında değerlendirildiğinde, persisters adı bakteri alt popülasyonu, çoğu zaman ortaya çıkar. Bazı durumlarda, antibiyotik tedavisine uzun süreli bağışıklık lag kaynaklanmaktadır. Bu kurulumu kullanarak, bu gecikme ortaya ve genellikle önemsiz olmayan bir dağılımı 24 (Şekil 6) vardır. Bu yöntem, aynı zamanda az bulunan mutantların alınmasını sağlar. Örneğin, mutasyona uğramış bir nüfus kaplama sonrası, mutantlan fenotip göre tespit edilebilir ve seçim olmadan, direkt olarak izole edilmiştir. Kurulum da at kolonilerinin yoğunluğunun bir fonksiyonu olarak kolonilerin büyümesini ölçmek yoluyla hücre-hücre etkileşimleri izleyebilir ve bu çekirdek algılama veya sarılmış bakterilerin yayılması gibi olayları ölçmek için kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak gelecek deneylerle ortaya boyutlu bilgi mikrobiyal nüfusun daha iyi karakterizasyonu yol açacaktırs tıbbi ve çevresel araştırma gelişmeler.

Bakteriler çok stresli koşullara yanıt gelişmiştir. Strese adaptasyon genel özelliği, büyüme dinamikleri 1,2 bir değişimdir. Üstel büyüme oranı ve gecikme süresi, yeni koşullara uyum için gerekli yani zamanı: Büyüme dinamikleri iki parametre çoğunlukla karakterizedir. Yüksek verimli yöntemler, çok sayıda büyüme oranı ölçümleri odak ise yeni koşullara uyum karakterizasyonu için önemli bir parametre olan, ancak, gecikme süresi, çoğu zaman bir gözden parametredir. Değişen koşullara uyum Kantitasyonu geleneksel zahmetli manuel yöntemler 3,4 kullanılarak yapılmıştır. Daha yakın zamanda, gelişmiş teknikler tek hücre 5,6 analizi için geliştirilmiştir. Ancak, büyümenin gecikmesi yavaş büyüme (yani bir gecikme süresi) 2,3 aşağıdaki normal büyüme ayırt etmek hala zor. Otomatik bir yöntem, ScanLag 7 inşa edildiBu iki benzer fenotip arasında ayrım. Gecikme süresi dağılımının çalışmanın önemini çarpıcı bir örnek antibiyotik tedavisi altında ortaya çıkar. Antibiyotik ve diğer gerilmeler çoğu sadece aktif olarak büyüyen hücrelerini öldürmek ve bu nedenle, &quot;geri kalmış&quot; edilmiş hücreler 8 korunur. Gecikme süresini izlemek için, bir mikroskop altında tek hücreleri gözlemlemek ve ilk bölümü için zaman izleyebilirsiniz. Bu yöntemin bir dezavantajı, büyük bir dinamik zaman aralığı sınırlı olduğunu; Erken büyüyen bu hücreler daha uzun etkili bir gecikme süresi ile hücrelerin büyümesini azaltarak, üstel bir oranda yüzeyini kapsamaktadır. Akış odaları kullanımı biraz bu 5 circumvents, ancak hücrelerin sınırlı sayıda izlenebilir ve nüfusun çoğunluğu artan başladıktan sonra lag faz çıkmak bakterilerin fraksiyonu gözlenen olamaz. Bu kısıtlamalara rağmen, çeşitli çalışmalar di düzeyinin etkisi değerlendirilmiştirfferent tek hücre mikroskopi 9-12 kullanılarak gecikme süresi dağılımına vurguluyor. Gecikme süresi dağılımını izlemek için başka bir yolu bulanıklık ölçümleri 13,14 geçer. Her biri tek bir hücreden ait birçok paralel kültürler, zamanla kültüründe bakteri sayısını ölçen bir optik yoğunluk okuyucu yetiştirilmektedir. Bu yöntem, ekstrapolasyon hassasiyeti ile bir plaka içinde kuyu sayısı ile sınırlıdır. Otomatik bir yöntem bile çok uzun bir gecikme süresine sahip bir popülasyonda bakterilerin küçük bir yüzdesi için, değerlendirilecek gecikme süresi ve büyüme süresi dağılımı sağlayan, ScanLag adlandırılan geliştirilmiştir. Yöntem, geleneksel besleyici agar plakaları 15 (Şekil 1) kolonilerin tespiti dayanmaktadır. Algılamasını 16,17 periyodik plakaların görüntüleri elde etmek için ev yazılım tarafından yönlendirilir ticari tarayıcılar 18 bir dizi otomatikleştirmek için tasarlanmış oldu. Yazılım olduotomatik olarak görüntüleri analiz ve bu süre 80 piksel 20 piksel büyümeye olarak burada tanımlanan her koloninin, her koloni ve büyüme zamanı görünüm zamanı olarak kantitatif parametreleri 19,20, çıkarmak için tasarlanmıştır. Burada sistemin kurulum ve daha iyi bir kullanıcı arayüzü ile geliştirilmiş otomatik bir görüntü analiz yazılımı kullanımı da dahil olmak üzere, detaylı bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, bu tür morfolojisi ve rengi gibi koloni diğer özelliklerini ölçmek için adapte edilebilir. Bu tür parametrelerin ölçülmesi boyutlu phenomics olarak sistem kullanılmasını sağlayacaktır. Yöntem, tek hücrelerden koloniler tespit gibi, sistem nüfus düzeyinde ölçümleriyle ölçülemez yeni fenotipi ortaya çıkarabilir. Bu teknik az varyantlarının saptanması ve alınmasını sağlayan ve istenen özellikleri için tarama kolaylaştırır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Material</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Difco LB broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish 90mm</td>
			<td style="width:71px;">Miniplast</td>
			<td style="width:119px;">20090-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Epson Perfection v37</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B207201</td>
			<td style="width:167px;">Flatbed Scanner with Optical resolution: 4800 dpi, Hardware Resolution:&#160;4800 x 9600 dpi, color bit depth 48-bit.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection v200</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B188011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Epson Perfection 3490</td>
			<td style="width:71px;">Epson</td>
			<td style="width:119px;">B11B177011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ADU200 USB Relay</td>
			<td style="width:71px;">ONTRAK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">pieces of sterile black felt cloth</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>approximatly 100 x100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">white plate holders</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surface size, with 6 x 99mm diameter hole</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Delerin rings the size of the Petri dish</td>
			<td style="width:71px;">custon made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">inner diameter: 72 mm 
			outer diameter: 86 mm 
			top outer diameter: 90 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanlag: high-throughput quantification of colony growth and lag time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

Gecikme süresi dağılımı ekstre bir örnek olarak, Şekil 5, bir tarama deneyinde yapılabilir gibi, zaman içinde tek bir plaka üzerinde belirli özelliklere sahip her bir koloni tespit etmek ve izlemek için ScanLag yeteneğini göstermektedir. Mikroorganizmanın kültür heterojen olduğunda, farklı popülasyonlar deneyi sırasında kendilerini ortaya çıkarabilir. Örneğin, Şekil 6, bu görünüm niceliğini gösterir ve dolayısıyla E bir mutant suşu içinde bimodal duraklama süresi dağılımı ortaya koymaktadır coli. Hücrelerin büyüme hızı koloninin ortaya çıkış zamanı etkilemektedir. Koloniler aynı oranda Olgunlaştıklarında geç ortaya gecikme süresi (Şekil 7) atfedilebilir. Yöntem, gerçekten tek hücre gecikme süresini ölçen doğrulamak için, tek hücreli bir mikroskopi kullanılarak elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında, ScanLag; Bu doğrulama azalan birönceki bir yayında 7 ayrıntılı ribed. Bu yöntem mikroskobu ile değerlendirilebilir çok daha fazla hücre izlenmesini sağlar. Mikroskopi kullanılarak ve ScanLag kullanılarak elde edilen dağılımlar, büyük ölçüde üst üste gelir. ScanLag dağılımı biraz daha geniştir; teorik analizler bölünme zaman, standart sapmanın düzenin olduğu tahmin genişletmektedir. Büyüme süresi, her bir suş için farklı ise, görünüşte gecikmenin kökeni ayrıca diğer yöntemler kullanılarak incelenmelidir. Daha sonra kolonilerin görünüşüne erken görünen kolonilerin etkisi incelenmiştir. Kontrol deneyleri 7 daha sonra görünüm olarak uzun plaka başına kolonilerin sayısı (Şekil 8) 200&#39;ü aşmadı olarak etkilenmez olmadığını doğruladı. Başka bir kontrol deneyi plaka üzerinde koloninin yeri görünümü zaman 7 etkileyen olmadığını doğruladı. P analizilates büyüme ortamı veya mikroorganizma türü mevcut besin bağlı olarak değişiklik gerekebilir belirli eşikleri kalibre edilir. Şekil 9&#39;da gösterildiği gibi Bununla birlikte, analiz eşik geniş bir ürün yelpazesi için oldukça sağlamdır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Kolonisi görünüm dağılımını oluşturmak için gerekli adımların şematik diyagramı. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Bağlı tarayıcılar, ve yapılandırma dosyasının isimlerini gösteren Aygıt Yöneticisi bir ekran görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/5456/51456fig2highres.jpg" target="_blank">daha büyük görmek için lütfen buraya tıklayınız</a>Bu rakamın sürümü. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig3highres.jpg" width="500" /> Tarama Yöneticisi Şekil 3.. Bir ekran görüntüsü. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. ScanLagApp bir ekran görüntüsü. Plakasının bir görüntü, sol bölmede üzerinde olduğunu ve kılavuzda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi her koloninin büyüme eğrileri, sağ bölmedeki vardır. Iki veya daha fazla koloni birleştirme zaman koloniler alan eğrilerinin bazı ani ortaya çıkar. Kolonilerin birleştirme durumda, bu kolonilerin alan bağlantı bölgesi olarak kabul edilir. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Bir plakanın analiz temsili bir sonucu. (A), deney sonunda tespit uygulamanın çıkışı bir görüntü. Her koloni alanı tespit renkli ve benzersiz bir kimlik numarası atanır. Oklar Koloni (yoğunluk bir eşiğe dayalı olarak tespit edilir B&#39;de ölçülen temsil etmektedir koloniler LB agar veya M9 agar üzerine E. coli kolonileri için, bu eşiği 0.03 &#39;tür. Başka bir ortama veya bakteriler, bu eşik işlev ProcessPictures ayarlanabilir .) 10 piksel üzerinde sadece nesneleri (bu eşik işlev MatchColonies değiştirilebilir) sayılır. Bir koloninin Algılama yaklaşık 10 5 bakteri başlar. Bu plakanın dört temsili koloni zamana karşı piksel olarak alanın (B) araziler. Koloni tespit edildiğinde her koloninin &#39;görünümü zamanı&#39; olduğunu. Zaman sağa sola büyümeye olarak her koloninin &#39;büyüme zamanı&#39; burada tanımlanmıştır80 piksel (bu sınırların işlevini getAppearanceGrowthByVec kullanarak ayarlanabilir) m 20 piksel. Yazılım üst sınır ulaşmadan önce birleşerek kolonileri dışlar. Kendi özelliklerine göre özel bir koloni tanımlanması belirlenmesi sayısı ve her bir koloni atanan renk sayesinde son derece kolaydır. Örneğin 1. kolonilerinin, 56, 77 ve 124 hem de grafikler vurgulanır. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6.. Görünüm miktar modlu gecikme süresi dağılımını ortaya çıkarabilir., Iki farklı suşları için görünüm kez ScanLag analizi histogramlarının Karşılaştırılması. Mavi hat: yabani tip suşu katlanarak (Toplam: 1.320 koloniler) büyüyor; kalmış bakterilerin (: 1.529 koloniler Toplam) ile zenginleştirilmiş kırmızı hat-yüksek kalıcılık mutant. (A) Normalleştirilmiş görünüm histogramları. Pikkatlanarak büyüyen hücre görünümünü bir tespit koloni büyümeye tipik zamandır. Ankastre: Bimodal gecikme süresi dağılımını gösteren log-aralıklı bidonları üzerinde gerçek gecikme süresini almak için üstel kültürünün zirve zamanını düşüldükten sonra mutant suş aynı histogram. (B) logaritmik bir ölçekte, (A) &#39;da anlatılanla aynı verilerin Survival fonksiyonu. Bu gösterim mutant suşunun geç ortaya kuyruk artırır. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7. Görünüm dağıtım ve büyüme süresi dağılımı. (A) ve (B) iki boyutlu görünüm zaman histogramlarını ve iki farklı koşullar (Yazılım üst sınır ulaşmadan birleşti kolonileri hariç) büyüme zaman gösterecek. (C) histogramları karşılaştırılmasıBüyüme kez (D) benzer iken iki suşları görünümü zamanında fark göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51456/51456fig7highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig8highres.jpg" width="500" /> Şekil 8,. Erken Kolonilerin görünümü, daha sonra koloni görünümü ile karışmaz. (A), tek başına kaplama, vahşi tip hücre süre dağılımı kalmaktadır. (B) izin veren sıcaklığa transfer edildikten sonra, tek başına soğuk hassas bir soyun süre dağılımı kalmaktadır. (C) ile aynı koşullar altında bir araya kaplama her iki soy süresi dağılımı kalmaktadır. Siyah çizgi ayrı ayrı gerginlik ölçerken elde edilen verilere dayalı beklenen dağılımını gösterir. İyi birbeklenen ve ölçülen dağılımları arasında greement sürece plaka başına kolonilerin toplam sayısı 200, aşağıda olduğu gibi elde edilir. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig9highres.jpg" width="500" /> .. Şekil 9 algılama eşiği koloni görünüm dağıtım şeklini etkilemez koloni görünümü dağılımı iki farklı boyutlarda eşik kullanarak aynı veri kümesi için analiz edilmiştir; (A) eşik büyüklüğü 10 piksel; (B) eşik boyutu 50 piksel. Histogramının başına hücre sayısı: yakl. 1.500. Farklı algılama eşiği sadece algılama zaman bir kayma ile sonuçlanır. <img alt="Şekil 10," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig10highres.jpg" width="500" /> 10. Sıcaklık kararlılığı ölçümleri ACR ŞekilGüç Yönetimi olmadan tarayıcı üzerinde yetiştirilen Bacillus subtillis kolonileri ile bir levhanın oss tarayıcının yüzey. (A) görüntü. Yüzey alt sıcak olan ve bu nedenle koloniler daha hızlı büyür. Plakanın yanındaki kademeli hattı ısı derecesinde bir şematik temsilidir. (B) ısı stabilitesi, tarayıcının yüzeyi boyunca yerleştirilmiş iki termokupl ile ölçüldü. Tarayıcı her tarama sırasında ve zamanla ısınır. (C) Güç Yönetimi ile, sıcaklık üniforma ve koloniler benzer oranlarda büyür. (D) Güç Yönetimi modülü ile (B) aynı. ± 0.2 ° C sıcaklık kararlılığı <img alt="Şekil 11" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51456/51456fig11highres.jpg" width="500" /> Şekil 11. Görünüm dağılımındaki farklılıklar di bağlı olabilirKatı ortamın hacimlerde fferences. Aynı bakteri kültürü agar yüzeyinden farklı yükseklikte sonuçlanan LB agar farklı hacimlerde plakaları üzerine kaplanmıştır. Farklı yükseklikleri plakaların farklı donukluk ve bu nedenle farklı bir zamanda algılama yol açtı. Arası plakalar fark kontrol ve farklı yükseklik koşulları arasındaki fark edildi. LB Agar 30 ± 0.5 ml eşit hacimlerde plakaları arasındaki (A) tipik farklar. Farklı yükseklik koşullar arasında (B) Fark: görünüm dağıtımı 30 ± 0.5 ml (yeşil) ve 40 ± 0.5 ml (mavi), 20 ± 0.5 ml (kırmızı) hacimli plakaları için ölçülmüştür. Her koşul, 6 farklı plakalar ortalamasıdır. Sürece levhaların hacmi ± 5 ml aralığı içinde olduğu gibi, benzer bir donukluk ve benzeri bir görünüm süresi dağılımına yol açar.

Watch this Scientific Journal Video about ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time at JoVE.com

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag: Yüksek verim Colony Büyüme niceliksel ve Zaman Lag

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

scanlag-high-throughput-quantification-of-colony-growth-and-lag-time

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.0K Görüntüleme.  The Hebrew University of Jerusalem. ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

Video: ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...