Bu çalışma NIH hibe DP2OD008470 tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Ringer Solüsyonu Hazırlama <ol><li> Herhangi bir tuz çökelmesini önlemek için sürekli karıştırma ile, aşırı saf, H2O ile 116 mM NaCI, 2.9 mM KCI, 3.6 mM CaCl2, 5 mM Hepes ihtiva eden bir çözelti yapmak. </li><li> Tuzları, ekleme ve çözelti hala karıştırma sırasında sonra, 100 birim / mL başına penisilin ve ml başına 100 ug streptomisin ilave edin. </li><li> Tüm antibiyotik ve bunların tuzlarını ilave edildikten sonra, steril bir kap içinde çözelti ve mağaza filtre sterilizasyonu gerçekleştirin. Not: N-feniltiyoüre (1-fenil-2-tioüre) ya da PTU embriyo sağlığına olumsuz sonuçlar doğurmadan kordon implante edilen embriyoların pigment oluşumunu engellemek için bir Ringer çözeltisine ilave edilebilir. Ringer / pigmentasyon bloke çözeltisinin hazırlanması için, konsantre ve kullanımı% 0.003 PTU trasyon. Nedeniyle PTU düşük konsantrasyona PTU tozun küçük miktarlarda eklenmesi önlemek için, Ringer çözeltisi daha büyük bir birim, en az 1 L yapılması tavsiye edilir eklenmelidir. Çözelti karıştırma sırasında, Aşama 1.2 sırasında PTU ekleyin. </li></ol> 2. Tricaine Çözelti Hazırlanması <ol><li> 9.5 arasında bir pH değerine, dengeli bir 1 M stoktan, çözeltisi artı 0.1 M Tris her bir L başına Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Tricaine) 2 g ekleyin ve ultra saf H2O ile yapılan Not: Tricaine boncuk implantasyon fenotipleri tahlil istenen bir zaman noktasında zebrabalıkları embriyolar ötenazi için kullanılacaktır. </li></ol> 3. E3 Çözüm Hazırlığı <ol><li> E3 1 L oluşturmak için, 0.25 M NaCI, 10 mM KCI, 12.5 mM CaCI2 ve 16.6 mM MgSO 4 ultra saf su L 1 bir çözelti yapmak. </li><li> Mantar gelişimini inhibe etmek için, E3 çözeltisine Metilen Mavisi 200 ul ekle. </li></ol>Microbead Transferi 4. Çekme İğneler <ol><li> Bir OD filament ile ateş cilalı borosilikat cam kullanın: 1,0 mm, ID: 0.5 mm, 10 cm uzunluğunda. </li><li> İnce iğne hazırlamak için Mikropipet çektirmenin içine borosilicated cam yerleştirin. Not: = 245, Velocity = 200 ve Zaman = 125 çekin, Isı = 540: Aşağıdaki dört boyut iğne çekmek için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir. </li><li> Iğne yeterli sayıda çekerek sonra, kapalı plastik mağaza kullanıma kadar, modelleme kil veya iğne ucu kırılma önlemek için yapışkan bant şeritler üzerinde konumlandırılmış yemekler, petri. </li><li> İstediğiniz delik boyutuna iğne ucu kırpmak için, iğnenin ucunu puan ince forseps bir çift kullanın. Not: İğne delik boyutu microbead boyutu kullanılan yanı sıra kullanıcı taşıma tercihleri ​​ediliyor bağlı olarak değişecektir. 50-100 um arasında değişen mikro-kullanılacak olması durumunda iyi bir başlangıç ​​noktası 100 ve 200 um arasında bir aralıkta zanaat motorunun boyutları etmektir. </li><li> Prior tamamlanan microbead transferi enstrüman moda kılcal boru tutucu içine kesilmiş iğneyi kullanmak. </li></ol> 5. Bıyık / Kirpik Aracı Hazırlama <ol><li> Bir bıyık edinin kirpik ya da doğal ya da sentetik saç filamanın diğer küçük ama sağlam bir parça. 45 ° &#39;lik açıyla filamanın üssü yakınlarında kesti. Kalıcı net yapıştırıcı tutkal kullanarak, bir P-1000 mikropipet ucu bıyık uyun. </li></ol> 6. microbead İmplantasyonu Tepsi Hazırlık <ol><li> E3 çözeltisi, 100 ml% 2&#39;lik bir E3 agaroz jeli yapmak için olan agaroz 2 g karıştırın. </li><li> Içinde köpüren jelin önlemek amacıyla şişeye her 30 saniyede bir dönen, 250 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 1 dakika ve 30 saniye süreyle% 2 agaroz çözeltisi ısıtın. </li><li> 60 mm x 15 mm petri kapağını alın ve yukarı bakacak iç ile daha büyük, 150 mm x 15 mm çanak yerleştirin. </li><li> Aşağı demirlemek için emin olun, 150 mm x 15 mm petri içine sıcak agaroz jel dökünişaret parmağı ile küçük çanak kapağı. Not: jel dökerken oluşturacak yoğunlaşma kaldırmak için küçük çanak kapağın altında agaroz ince bir tabaka izin ver; Bu bir diseksiyon mikroskop altında görmek için boncuk daha kolay hale getirecek. </li><li> Agaroz soğurken katılaşır önce ama, jel üzerinde iyi kalıp yerleştirin. Bu embriyo kolay yerleştirilmesi için izin verir. </li><li> Not: Bu jel üstünde yüzen kadar kuyularda kabarcıklarını önlemek için, bir açı ile yavaşça kalıp yerleştirin. </li><li> Jel katılaşmış bir kez microspatula kullanarak, dikkatle de kalıp çıkarmak. 4 ° C&#39;de E3 solüsyonu ve mağaza ekleyin. </li></ol> 7. Embriyo Koleksiyon <ol><li> Sistem su ile dolduruyor ve daha sonra odalarına O / N yetişkin zebrabalıkları erkek (ler) ve dişi (lar) çiftleri koyarak, bölücüler ile ayrılmış çiftleşme odaları, hazırlayın. </li><li> Bir ince tel örgü süzgeç kullanarak döllenmiş yumurta toplamak (embriyonik aşamaları biraz değişecektir). </li><li> Orada çanak E3 çözeltisi yaklaşık 25 ml süzgeç bırakılan yumurta kalmayana dek ters süzgeç tornalama ve E3 ince bir akımı ile durulanarak, temiz, 10 cm çapında bir Petri tabağına döllenmiş yumurta bırakır ve. </li><li> Toplandıktan sonra, debriyaj içinde gelişim asenkroni yol ve zor istenilen kat puan toplayarak hale getirebileceğini aşırı kalabalık önlemek için çeşitli yemekler (tabak başına yaklaşık 50-60 yumurta) içine yumurta bölmek. </li><li> Standart zebrabalıkları evreleme serisi 40 göre gelişimsel değerlendirme etkinleştirmek için 28.5 ° C&#39;de E3 çözeltisi içinde embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. Not: embriyolar eski aşamalarında manipülasyonlar optik netlik gerektiren eğer pigment gelişimini önlemek için 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) E3 / PTU transfer edilmelidir. </li></ol> 8. Boncuk İmplantasyonu <ol><li> Istenen test molekülü konsantrasyonunda mikroboncukları veya karşılık gelen araç s inkübeuygun bir hacmi için gerekli bir süre için ların çözüme. Not: Araştırmacı steril Petri 3-6 cm çapında değişen yemekler, veya çözelti içinde mikro-görselleştirme sağlayacak her ikisi de çok-yuvalı plakalar, kullanabilir. Zaman tipi ve ilgili molekülün miktarına bağlı olarak değişebilir ve araştırmacı gibi ışık ve sıcaklık hassasiyeti olarak inkübasyon ve diğer yönleri süresince üretici ya da yayınlanan önerileri başvurmalıdır. </li><li> Embriyolar istenilen gelişimsel zaman noktasını ulaştığınızda, ince forseps kullanarak chorions embriyolar kaldırın. </li><li> Çözeltiye bunları alışmaları için 10 dakika boyunca antibiyotik süzüldü Ringer çözeltisi embriyolar inkübe edin. </li><li> Embriyolar acclimating iken, implantasyon tepsi içinde yer mikroboncuk plaka mikroboncukları transferi ve 10 dakika boyunca Ringer çözeltisi ile durulayın. Not: Bu noktaya ulaştıktan sonra 50 dakika içinde boncuk implante. Bu wHasta bir ilgi, molekülün daha küçük bir konsantrasyon ile bir boncuk implante olasılığını azaltır. </li><li> Implante edilecek microbead erişilebilir nereye kadar ilgi alanına onları yönlendirmek için özen microbead implantasyon tepsisinin kuyulara embriyolar dizisi. </li><li> Tungsten iğne kullanılarak embriyo üzerinde küçük bir kesi yapmak. </li><li> Microcapillary transfer pipet kullanarak embriyo üzerine microbead aktarın: pipet ampul karartıcı, yavaşça kılcal sütuna microbead çekin ve sonra istenen hedefe microbead transfer basıncı boşaltın. </li><li> Embriyo içinde microbead konumlandırmak için bıyık / kirpik aracını kullanın. Not: iyileşene kadar microbead embriyo ihraç olmayacak şekilde kesi sitesinden uzak dokuya microbead konumlandırmak için emin olun. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Geçtiğimiz yüzyılda, vücut planı desen ve organogenez anlayışı anıtsal gelişmeler uğramıştır. Doku manipülasyon teknikleri bu hayati süreçler hakkında önemli bilgiler açığa çıkarmak kritik idi. Genetik modifikasyonlar gen fonksiyonu tespit etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biri, ve bu hücre transplantasyonu olarak mozaik analiz yöntemleri, gen fonksiyonunun otonomisini anlamak için yararlı bir yaklaşım sağlarlar. Microbead implantasyon bu yöntem sinyal molekülleri veya inhibitörleri getirerek bir lokal doku ortamı değiştirmek için araştırmacı sağlayan olarak, gelişimsel dinamikleri nasıl değiştirdiğini belirli molekülleri sorgulamak için başka bir mekan sağlar. Farklı mikro bir dizi farklı boyutlar ve diğer fiziksel özellikler de ilgi deney koşulları için kullanılabilir, öyle ki (örneğin, şarj) mevcut olması, ticari olarak temin edilebilir. Böylece, bir protein veya kimyasal ıslatılır mikroboncuklar implanteBir organizmanın içinde ilgi cal, araştırmacılar gelişim sırasında lokalize etkilerinin araştırılması ve gen veya ilgi ve özellikle biyolojik fenotip (ler) molekülü arasındaki ilişkiyi bulabilirsiniz. Böyle zebrabalıkları 23 ön neurocranium (ANC) iskelet yapısının artan Kirpi sinyalizasyon etkisini değerlendirmek amacıyla microbead implantasyonu kullanılan Wada tarafından gerçekleştirilen bir ve meslektaşları olarak çalışmalar. Önceki çalışmalar, Shh ANC formasyonu 14 için gerekli olduğunu göstermiştir. Kullanımı Şşş kaplı mikroboncuklar araştırmacılar bu sinyal DÖB kıkırdak oluşumunu teşvik ettiğini belirledi. microbead implantasyon işlemi DÖB Kirpi sinyalizasyon ve kıkırdak oluşumu arasında açık bir bağlantı göstermek için kullanılmıştır. Bilim adamları eritroblastom Yirmi altı transkripsiyonel kontrol araştırdık nerede zebrafish bu doku manipülasyonu tekniğinin bir diğer önemli örnek çalışmalarda gözlenmiştir (ETS) etki faktörler ETS ilgili molekül (Erm) ve erken zebrabalıkları beyin gelişimi 19 sırasında FGF sinyalizasyon tarafından Polyoma arttırıcı aktivatör 3 (Pea3). Microbead implantasyon deneyleri sayesinde, onlar FGF8 ve Fgf3 ektopik erm ve Pea3 ifadesini aktive göstermek başardık. Bu örnekler, gen ekspresyonunu değerlendirmek için 41 yöntemleri ile iyi karakterize edilebilir, doku oluşumu sırasında işbirliği gelişim mekanizma içine anlayış sağlamak için mikro yararını göstermektedir. Böylece, microbead nakli gibi böbrek yol açan orta mezoderm (IM) gibi diğer dokuları, keşfetmek için uygun bir yöntem olabilir. Özellikle, nefron 42 segmentasyon ve 43,44, sadece yüzeysel şu anda anlaşılan süreçler tubulogenesis nasıl etkilediğini farklı moleküller araştırmak için, böbrek gelişim çalışmalarında yardımcı olacaktır. Ayrıca, microbead implantasyonu damızlık için kullanılmaya başlanmıştır ettizebrabalıkları 29] ve y rejenerasyon işlemleri gibi karşılık gelen yetişkin yapılarıyla araştırma yapmak için formüle edilmiştir yöntemlerle nefron 45 veya bağlantılı olduğu gibi, embriyonik doku takiben lazer ablasyonu gibi, organ yenilenmesi model, herhangi bir sayı ile kullanılmak üzere adapte edilebilir 46-49. Son olarak, mikroboncuk implantasyon kanser 50,51 veya doku dejenerasyonu 52,53 insan hastalık modelleri, kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir. Mevcut protokolde, biz de benzer şekilde, diğer araştırmacılar tarafından açıklanan, ancak video protokolleri 1 ile gösterilmeyen olmuştur Zebra balığı embriyolarının microbead implantasyonu, yöntemini göstermektedir. Minimal uygulama ile biz araştırmacı bazı tecrübeye sahip bir zamanlar bu prosedürün fizibilitesini ilgilidir 8-10 embriyoların yaklaşık oranı / saat, en mikroboncukları implant başardık. Burada gösterilen sonuçlar, çeşitli d o boncuk göstermektedirimensions erken dönemde implante edilebilir ve dikkatle ki bu doku manipülasyonu tekniği embriyo minimal fiziksel bozulma ile uygulanabilir. Vurgulanmalıdır Bir gelişme embriyo mikroboncuk konumlandırmak için bir bıyık / kirpik aracının kullanılmasıdır. Bu ekipman nispeten ucuz ve basit parça mikroboncuk aynı çapta hakkında elde etmek kolaydır ve implantasyon sürecini hızlandırmak yardımcı olur. bıyık / kirpik araştırmacı el becerisi ve tercihine bağlı olarak, henüz narin boncuk işleme aracı bir firma üretmek için istenen uzunlukta kesilebilir. Burada fiziksel implantasyonu gerçekleştirmek için mikroboncukları ve zebra balığı embriyolar işlemek için nasıl tarif ederken son olarak, bu protokol, farklı ilaçlar veya peptidler için özel taşıma prosedürleri anahat değildir. Genel olarak, kimyasal işlem görmüş mikro-organizmanın başka alanlarda istenmeyen etkileri engellemek için, çıkar olan hayvana implante edilmesi gerekir, ve araştırmacılar de olmalıdırçalışmalarını başlatmadan önce bu tür kimyasallarla ilişkili olası güvenlik kaygıları hakkında kurdu. Sonuç olarak, biz laboratuarda kolayca bulunabilen başlangıç ​​malzemeleri kullanılarak, geniş bir uygulama yelpazesi ile nispeten basit ve etkili bir mikroküre implantasyon yöntemi gösterilmiştir. Sonuçta, biz bu kılavuz Zebra balığı doku manipülasyonu hassas doğası ile araştırmacıların yardımcı olacağını umuyoruz.

Gelişim biyolojisi araştırmacılar, bir organizmanın nasıl oluştuğunu kontrol eden mekanizmaları ortaya çıkarmak için, hücresel, moleküler ve genetik yöntemlerle geniş bir dizi kullanmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında, doku manipülasyonu hücre kaderi, hücresel hareketi ve dokuların organizasyonu konusunda karmaşık soruları çözmekte önemli bir araçtır. Lokal doku ortamları değiştirmek için bir yolu, protein ya da diğer sinyal molekülleri 1 odak kaynağı sağlamak için kullanılan mikro-cerrahi uygulanması yoluyla. Deneysel manipülasyon Bu tip yaygın tür kurbağa ve civciv 2 gibi klasik omurgalı embriyoloji modelleri, uygulamaya konmuştur. Zebra balığı organogenez çalışma için önemli bir omurgalı bir model organizma haline ve insanlarda 6 yüksek genetik koruma payı olarak da hastalık modelleme 3-5 birçok benzersiz avantajlar sağlamaktadır etti. Özellikle, optik saydamlık ve eskiZebra balığı embriyonun gelişim modu, harici doku ontogeny 3-5 gözlem için eşsiz bir bakış açısı sunuyor. Büyük ölçekli ileri genetik ekranlar uygulanması daha fazla çalışma 7,8 ve verimli bir şekilde tek bir laboratuarlarda 9,10 azaltılmış ölçekte gerçekleştirilebilir Alternatif tarama teknikleri tanımlanması için zebra balığı mutant güçlü bir depo üretti. Daha fazla zebrabalıkları ile deneysel çalışmalar transgenik metodolojiler gelişmelere yoluyla kolaylaştırılabilir ve genetik yaklaşımlar 11,12 yanı sıra kimyasal genetik 13-15 tersine olmuştur. Bu tür mikro uygulanması gibi doku manipülasyon teknikleri yaygın zebrafish istihdam olarak, ama yine de daha da geliştirilmesi sırasında hücre sinyallerini anlamak için yararlı bir araç sağlamak değil. Microbead implantasyon zebra balığı retinada organ oluşumu süreçlerini sorgulamak için kullanılmıştır16,17 kalp 18, beyin 19-22, nöral krest 23 ve 24,25 fin. Bu ve diğer çalışmalarda, boncuk geçişlerini hücre göçü 27 ve eksenel desenlendirme 28 nasıl etkilediğini sinyal molekülleri 26 difüzyonunu anlamak için gelişim sırasında uygulanmıştır. Daha yakın zamanda, mikro-zebra balığı yetişkin 29 yenilenmesi mekanizmaları değerlendirmek için kullanılmıştır. Gelişimsel çalışmalarda, örneğin, Zebra balığı microbead çalışmaları göğüs yüzgeci 25 çalışmalarla bacak oluşum mekanizmalarına anlayışlar sağladı. Zebra balığı göğüs yüzgeci tomurcuk fare, 30 ve civciv 31&#39;inde ön ayakları tomurcuk homolog olduğunu. Omurgalı bacak tomurcuk iki temel sinyal düğümleri vardır: kutuplaştırıcı aktivite Sonic dikenli ifadesi ile ön-to-arka eksen kurar (ZPA) (Shh) ve mansap Hox gen hedeflerinin bölge,ve fibroblast büyüme faktörünün ekspresyonu (FGF&#39;ler) vasıtasıyla kolun distal kimliğine proksimal kurmak için hareket bacak tomurcuk, ucunda mevcut apikal, ektodermal bir sırtın (AER). zebrabalıkları Shh genetik mutantlar, araştırmacılar içine FGF batırılmış mikroboncukları implante Omurgalı uzvun 25 hücre döngüsünün ve büyüme ilerlemesi için gerekli olduğu FGF belirledi. Buna ek olarak Konumsal kimlik oluşturmak FGF ve Shh sinyalizasyon kaskadlar, kimlik 32 posterior anterior kurmak için kutuplaştırıcı bölgenin eylem taklit ederek molekül olarak retinoik asit (RA) tespit civciv bacak tomurcuk kullanarak öncü çalışmalar. Civciv bacak içine RA-batırılmış whatman küçük kağıt parçaları konur katılan Bu deneyler haneli desenlendirme 32 değerlendirmek için. Bundan başka, araştırmacılar, mikro kullanımını kullanan diğer şık çalışma yapmıştır, hücre transplantasyonu ve eksojenZebra balığı RA RA tedavileri Zebra balığı Beyin ve mezoderm 28 içinde uzun menzilli pozisyonel ipuçları sağlamak için hareket ettiğini tespit etmek. Ancak, şu anda birçok soru omurgalı gelişme birçok açıdan sırasında FGF ve RA gibi faktörlerin sinyal rolleri hakkında kalır. RA sinyal etkisi, bir morfogen gibi davranan, böyle RA proksimal böbrek hücreleri kaderlerini 35-39 tip belirten gelişen kalp ve böbrek 34 atalarıdır gibi pek çok organı 33, darbe. Bu tür konuların daha iyi anlaşılması doku manipülasyon ve microbead implantasyon teknikleri kullanılarak deneysel çalışmalar önemli ölçüde yarar olabilir. Civciv gibi modellere kıyasla daha az çalışma Zebra balığı, içinde microbead implantasyonu ile yapılmıştır ederken, yürütülen edilmiş olanlar son derece bilgilendirici olmuştur. Zebra balığı embriyo microbead implantasyon esaslı araştırma azlığı bir nedeni likel olduğunuy bir engel başarıyla tür manipülasyonlar gerçekleştirmeden oluşturan embriyonun büyüklüğü dayalı, zor teknik zorluklar var olduğu fikri. Ancak, Zebra balığı embriyolar microbead implantasyon uygulaması ile öğrenilen ve tekniğin görsel gözlem yoluyla yardım ve böylece kalkınma mekanizmaları sorgulamak için bir araç olarak takip edilebilirler. Burada, doku oluşumu ve hücre morfogenez ilgili tahlillerde çeşitli iletilmesi için kullanılabilir zebra balığı embriyo, bir mikroboncuk kesin uygulama göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FB-500-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2707402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly Sulfoxide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45-106 &#181;m)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140-1454 AG1-X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45 &#181;m)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>7314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube holder</td>
			<td>Globe Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>51674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

Zebra balığı gelişimsel biyoloji ve hastalığın çalışma için değerli bir genetik model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Balığı insanlar dahil olmak üzere, diğer omurgalıların, hücresel, moleküler, fizyolojik süreçlerde yüksek genomik koruma derecesinin yanı sıra, benzerlikleri vardır. Erken ontogeny sırasında, Zebra balığı embriyolar araştırmacılar, basit bir stereomikroskop kullanılarak organogenez dinamiklerini görselleştirmek için izin optik şeffaftır. Microbead implantasyonu, yerel ortamlarında faktörlerin değiştirilmesi yoluyla doku manipülasyonu sağlayan bir yöntemdir. Bu araştırmacılar, gelişmekte olan embriyonun içindeki spesifik uzaysal ve zamansal noktada salgılanmış peptidler gibi ilgi konusu sinyal molekülleri, herhangi bir sayıda etkilerini tahlil sağlar. Burada, biz detay erken zebrabalıkları gelişimi sırasında manipüle ve implant boncuklar nasıl bir protokol.

Manipülasyon araçları çeşitli tipleri araştırma uygulamaları (Şekil 1), mikro-boncuklar için yararlıdır. Buna ek olarak, küçük kuyuları ile basit bir agaroz kalıp zamanında ve etkin bir şekilde (Şekil 1), bu deneyler gerçekleştirmek için hayati önem taşımaktadır Zebra balığı embriyo tutmak için kullanılabilir. Bir mikroboncuk implantasyonu araştırmacılar ilgi molekülü için spesifik bir eylem pencere dar sağlar mekansal bir konuma ve ilgili zamansal safhada gerçekleştirilebilir. Burada, tek mikroboncuklar kuyruk tomurcuk aşamasında Zebra balığı embriyolarının içine veya somitogenesis aşamaları (Şekil 3) sırasında daha sonra zaman noktalarında implante edildi. Tek başına Ringer çözeltisi ile çalkalandı iki farklı büyüklükteki mikro-boncukları, bu protokol gösteri (Şekil 3A, 3B ve 3C) kullanılmıştır. Herhangi bir konjuge yokluğunda bu microbead implantasyonuküçük moleküller boncuk implantasyonu Zebra balığı embriyo (Şekil 4) uygun gelişimi sırasında brüt morfolojik etkileri olmadan elde edilebileceğini göstermektedir. Deneyciler embriyo üzerinde bir tungsten iğne ile yapılan delinme deliğe microbead manevra zorluklar karşılaşabilirsiniz. Bir kez mikro iğne ile embriyo yerleştirilen mikroboncuk daha iyi yol tutuşu elde etmek için, bir bıyık / kirpik aracı kullanılabilir. Diğer doğal veya sentetik kirpik filamanlar (Şekil 1) kullanılabilir, ancak bu, doğal olarak kedi veya köpek bıyık döken ile hazırlanmış olabilir. Tungsten iğne veya bıyık aracı ile ya mikroboncuk bir nazik itme microbead kalıp Ringer çözeltisi içine batar görmelisiniz. Mikroboncuk kalıp içine batmış sonra eğer gerekiyorsa tungsten iğne kullanarak, büyük mesafelerde taşınması gereken ve bir kez embriyo tepesinde bir iğne ya da kıl aracı positio için kullanılabilirembriyonun içine microbead n. boncuk stabil dokuda konumlandırılmış kalacaktır olarak microbead implantasyon başarısı hemen bir stereomikroskopta görselleştirme yoluyla ölçülebilir. Zamanla boncuk konumunu değerlendirmek için, her embriyo örnek canlı zaman kurs fotoğraf yoluyla görüntülü olabilir ya da (Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi) boncuk konum nedeniyle endojen doku deney süresi boyunca kaymıştır değil emin olmak için periyodik aralıklarla kontrol morfogenez. Zamanla boncuk konumunu anlama bir hedef doku veya gelişim süreci, küçük bir molekül etkisini değerlendirmek olarak sonuç, en iyi şekilde bilinçli yorumlanması için kritik önem taşır. Bu yukarıdaki adımların kullanılması istenen zamanda ve konumda zebrafish embriyo içine mikroboncukları imbed etmek için ideal bir ortam sağlayacaktır. Bizim tecrübelerimize göre, bu microbead implantasyon protokolünün acemi kullanıcılar genellikle beceri NE kazandıUygulamada yaklaşık bir hafta sonra tek Zebra balığı embriyo içine mikro tutarlı cerrahi implantasyon gerçekleştirmek için cessary. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Şekil 1. Araçlar microbead implantasyonu gerçekleştirmek için kullanılır. (A) boncuk implantasyonu tepsi (sol, 15 cm çapında) embriyo kalıpları ile (solda) ve microbead kuluçka tepsi (sağda, 6 cm çapında). Bu çalışma tepsi araştırmacı microbead implantasyonu için istenen yönelim içine embriyolar yerleştirmek ve mikroskop istasyonunda yakın implantasyon için hazırlanan mikroboncukları sahip sağlar. Mikro-küreler, küçük molekül (ler) ve / veya araç içinde bekletilir ve daha sonra bir mikroskop istasyonunun altına yerleştirilmiş köşe implantasyon tepsisine yerleştirmeden önce, ayrı bir microbead plakasına (sağ) durulanmalıdır. (B), ince forseps iki çift chori kaldırmak için kullanılacakmicrocapillary iğnenin ucunu kırmak için ayrıca her Zebra balığı embriyo çevreleyen ve üzerinde. (C) tungsten iğne mikroboncuk konumlandırmak için zebrafish embriyo içine çok ince bir delik yapmak için istihdam edilecek. (D) microcapillary transferi pipet pick up ve delinme site yakınında Zebra balığı embriyonun üstünde bir microbead konumlandırmak için kullanılacaktır. (E) daha önce bir tungsten iğne ile yapılan embriyo içinde insizyon içine mikroboncuk nazik konumlandırma sağlayacak bıyık / kirpik aracı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Microbead implantasyon prosedürü Şekil 2. şematik. (A) mikro-soaki ile microbead implantasyon tepsisiİstenilen yıkama çözeltisi içinde ng bir stereomikroskopta istasyonu altında kurmak ve embriyolar doku yukarı bakacak şekilde konumlandırılmış. Tungsten iğne kullanarak (B), embriyo içine küçük bir kesi hafif ama güçlü hareketi ile yapılabilir. Bir microcapillary transfer pipet kullanarak (C), istenen microbead sağda bulunan tepsideki microbead kuluçka odasına aldım ve embriyo çalışma alanı yer almaktadır sol bölmeye getirilebilir. microbead insizyon yeri yakınlarında tevdi edilmelidir yavaşça bıyık / kirpik aracını kullanarak tungsten iğne ile yapılan kesi içine yerleştirilmiş. Bir microbead kesi içine manevra sonra, stabil microbead konumlandırmak ve gelişme devam ettikçe embriyo dışarı sonraki hareketini engellemek için (Ensizyondan uzak) doku içine sıkışmış edilmelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>kira bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Şekil 3. mikroboncukları farklı gelişim aşamalarında embriyolar implante edilebilir. (A) Zebra balığı embriyolar kuyruk tomurcuk aşamasında gövde içine mikroboncuk (yaklaşık 50 mikron çapında) yerleştirildi. 24 saat sonrası boncuk implant (hpbi) olarak incelendiğinde, embriyolar normal geliştiği ve microbead gelişimsel zamanın geçişi sırasında minimal hareketi gösterdi. 3 hücre gruplarının aşama (P) de sarısı kesesinin içine (yaklaşık 50 um&#39;lik bir çapa sahip) mikro implante (B) balığı embriyolar zaman içinde nispeten küçük bir kordon hareketiyle normal gelişimini göstermiştir. (C) daha büyük mikro-(yaklaşık 70 um çapında) benzer şekilde, normal sonraki gelişimini, yanısıra mini gösterdi 7 ss embriyo içerisine implante edildimal implantasyon siteden herhangi bir hareket. eğer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Zebra balığı embriyo Şekil 4. Brüt gelişimi 72 hpbi ile mikroboncuk varlığı ile tedirgenmemis olan. Balığı embriyolar 7 hücre gruplarının aşaması (SS) (yaklaşık 50 um&#39;lik bir çapa sahip) Ringer çözeltisi içinde ıslatılmış mikro implante edildi. Her microbead cerrahi Somitlerin 3 ile 4 arasında, gövde içine sokulmuş boncuk varlığı 24 saat sonrası boncuk implant açık gelişimsel kusurlar (hpbi), 48 hpbi veya 72 hpbi ile ilişkili değildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K Görüntüleme.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gelişim Biyolojisi

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Kordalı embriyo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Zebra balığı embriyo, dinamik, kararlı ve doğmakta olan mikrotübüller analiz etmek için Immunolabeling kullanımı

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM ve Zebra balığı embriyo sarısı hücre Microrheology

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Hava sıyırma iki Salmonid balık, etkinliğini gökkuşağı alabalığı (Oncorhynchus Mykiss) ve kahverengi alabalık (Salmo Trutta morfin fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

En düşük Invaziv embriyo transferi ve tavşan modelinde optimum embriyo aşamasında embriyo vitrifikasyon

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...