Name: microbead implantation in the zebrafish embryo
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe DP2OD008470 tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol açıklanan Zebra balığı embriyolarının ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. Ringer Solüsyonu Hazırlama <ol><li> Herhangi bir tuz çökelmesini önlemek için sürekli karıştırma ile, aşırı saf, H2O ile 116 mM NaCI, 2.9 mM KCI, 3.6 mM CaCl2, 5 mM Hepes ihtiva eden bir çözelti yapmak. </li><li> Tuzları, ekleme ve çözelti hala karıştırma sırasında sonra, 100 birim / mL başına penisilin ve ml başına 100 ug streptomisin ilave edin. </li><li> Tüm antibiyotik ve bunların tuzlarını ilave edildikten sonra, steril bir kap içinde çözelti ve mağaza filtre sterilizasyonu gerçekleştirin. Not: N-feniltiyoüre (1-fenil-2-tioüre) ya da PTU embriyo sağlığına olumsuz sonuçlar doğurmadan kordon implante edilen embriyoların pigment oluşumunu engellemek için bir Ringer çözeltisine ilave edilebilir. Ringer / pigmentasyon bloke çözeltisinin hazırlanması için, konsantre ve kullanımı% 0.003 PTU trasyon. Nedeniyle PTU düşük konsantrasyona PTU tozun küçük miktarlarda eklenmesi önlemek için, Ringer çözeltisi daha büyük bir birim, en az 1 L yapılması tavsiye edilir eklenmelidir. Çözelti karıştırma sırasında, Aşama 1.2 sırasında PTU ekleyin. </li></ol> 2. Tricaine Çözelti Hazırlanması <ol><li> 9.5 arasında bir pH değerine, dengeli bir 1 M stoktan, çözeltisi artı 0.1 M Tris her bir L başına Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Tricaine) 2 g ekleyin ve ultra saf H2O ile yapılan Not: Tricaine boncuk implantasyon fenotipleri tahlil istenen bir zaman noktasında zebrabalıkları embriyolar ötenazi için kullanılacaktır. </li></ol> 3. E3 Çözüm Hazırlığı <ol><li> E3 1 L oluşturmak için, 0.25 M NaCI, 10 mM KCI, 12.5 mM CaCI2 ve 16.6 mM MgSO 4 ultra saf su L 1 bir çözelti yapmak. </li><li> Mantar gelişimini inhibe etmek için, E3 çözeltisine Metilen Mavisi 200 ul ekle. </li></ol>Microbead Transferi 4. Çekme İğneler <ol><li> Bir OD filament ile ateş cilalı borosilikat cam kullanın: 1,0 mm, ID: 0.5 mm, 10 cm uzunluğunda. </li><li> İnce iğne hazırlamak için Mikropipet çektirmenin içine borosilicated cam yerleştirin. Not: = 245, Velocity = 200 ve Zaman = 125 çekin, Isı = 540: Aşağıdaki dört boyut iğne çekmek için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılabilir. </li><li> Iğne yeterli sayıda çekerek sonra, kapalı plastik mağaza kullanıma kadar, modelleme kil veya iğne ucu kırılma önlemek için yapışkan bant şeritler üzerinde konumlandırılmış yemekler, petri. </li><li> İstediğiniz delik boyutuna iğne ucu kırpmak için, iğnenin ucunu puan ince forseps bir çift kullanın. Not: İğne delik boyutu microbead boyutu kullanılan yanı sıra kullanıcı taşıma tercihleri ​​ediliyor bağlı olarak değişecektir. 50-100 um arasında değişen mikro-kullanılacak olması durumunda iyi bir başlangıç ​​noktası 100 ve 200 um arasında bir aralıkta zanaat motorunun boyutları etmektir. </li><li> Prior tamamlanan microbead transferi enstrüman moda kılcal boru tutucu içine kesilmiş iğneyi kullanmak. </li></ol> 5. Bıyık / Kirpik Aracı Hazırlama <ol><li> Bir bıyık edinin kirpik ya da doğal ya da sentetik saç filamanın diğer küçük ama sağlam bir parça. 45 ° &#39;lik açıyla filamanın üssü yakınlarında kesti. Kalıcı net yapıştırıcı tutkal kullanarak, bir P-1000 mikropipet ucu bıyık uyun. </li></ol> 6. microbead İmplantasyonu Tepsi Hazırlık <ol><li> E3 çözeltisi, 100 ml% 2&#39;lik bir E3 agaroz jeli yapmak için olan agaroz 2 g karıştırın. </li><li> Içinde köpüren jelin önlemek amacıyla şişeye her 30 saniyede bir dönen, 250 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 1 dakika ve 30 saniye süreyle% 2 agaroz çözeltisi ısıtın. </li><li> 60 mm x 15 mm petri kapağını alın ve yukarı bakacak iç ile daha büyük, 150 mm x 15 mm çanak yerleştirin. </li><li> Aşağı demirlemek için emin olun, 150 mm x 15 mm petri içine sıcak agaroz jel dökünişaret parmağı ile küçük çanak kapağı. Not: jel dökerken oluşturacak yoğunlaşma kaldırmak için küçük çanak kapağın altında agaroz ince bir tabaka izin ver; Bu bir diseksiyon mikroskop altında görmek için boncuk daha kolay hale getirecek. </li><li> Agaroz soğurken katılaşır önce ama, jel üzerinde iyi kalıp yerleştirin. Bu embriyo kolay yerleştirilmesi için izin verir. </li><li> Not: Bu jel üstünde yüzen kadar kuyularda kabarcıklarını önlemek için, bir açı ile yavaşça kalıp yerleştirin. </li><li> Jel katılaşmış bir kez microspatula kullanarak, dikkatle de kalıp çıkarmak. 4 ° C&#39;de E3 solüsyonu ve mağaza ekleyin. </li></ol> 7. Embriyo Koleksiyon <ol><li> Sistem su ile dolduruyor ve daha sonra odalarına O / N yetişkin zebrabalıkları erkek (ler) ve dişi (lar) çiftleri koyarak, bölücüler ile ayrılmış çiftleşme odaları, hazırlayın. </li><li> Bir ince tel örgü süzgeç kullanarak döllenmiş yumurta toplamak (embriyonik aşamaları biraz değişecektir). </li><li> Orada çanak E3 çözeltisi yaklaşık 25 ml süzgeç bırakılan yumurta kalmayana dek ters süzgeç tornalama ve E3 ince bir akımı ile durulanarak, temiz, 10 cm çapında bir Petri tabağına döllenmiş yumurta bırakır ve. </li><li> Toplandıktan sonra, debriyaj içinde gelişim asenkroni yol ve zor istenilen kat puan toplayarak hale getirebileceğini aşırı kalabalık önlemek için çeşitli yemekler (tabak başına yaklaşık 50-60 yumurta) içine yumurta bölmek. </li><li> Standart zebrabalıkları evreleme serisi 40 göre gelişimsel değerlendirme etkinleştirmek için 28.5 ° C&#39;de E3 çözeltisi içinde embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. Not: embriyolar eski aşamalarında manipülasyonlar optik netlik gerektiren eğer pigment gelişimini önlemek için 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) E3 / PTU transfer edilmelidir. </li></ol> 8. Boncuk İmplantasyonu <ol><li> Istenen test molekülü konsantrasyonunda mikroboncukları veya karşılık gelen araç s inkübeuygun bir hacmi için gerekli bir süre için ların çözüme. Not: Araştırmacı steril Petri 3-6 cm çapında değişen yemekler, veya çözelti içinde mikro-görselleştirme sağlayacak her ikisi de çok-yuvalı plakalar, kullanabilir. Zaman tipi ve ilgili molekülün miktarına bağlı olarak değişebilir ve araştırmacı gibi ışık ve sıcaklık hassasiyeti olarak inkübasyon ve diğer yönleri süresince üretici ya da yayınlanan önerileri başvurmalıdır. </li><li> Embriyolar istenilen gelişimsel zaman noktasını ulaştığınızda, ince forseps kullanarak chorions embriyolar kaldırın. </li><li> Çözeltiye bunları alışmaları için 10 dakika boyunca antibiyotik süzüldü Ringer çözeltisi embriyolar inkübe edin. </li><li> Embriyolar acclimating iken, implantasyon tepsi içinde yer mikroboncuk plaka mikroboncukları transferi ve 10 dakika boyunca Ringer çözeltisi ile durulayın. Not: Bu noktaya ulaştıktan sonra 50 dakika içinde boncuk implante. Bu wHasta bir ilgi, molekülün daha küçük bir konsantrasyon ile bir boncuk implante olasılığını azaltır. </li><li> Implante edilecek microbead erişilebilir nereye kadar ilgi alanına onları yönlendirmek için özen microbead implantasyon tepsisinin kuyulara embriyolar dizisi. </li><li> Tungsten iğne kullanılarak embriyo üzerinde küçük bir kesi yapmak. </li><li> Microcapillary transfer pipet kullanarak embriyo üzerine microbead aktarın: pipet ampul karartıcı, yavaşça kılcal sütuna microbead çekin ve sonra istenen hedefe microbead transfer basıncı boşaltın. </li><li> Embriyo içinde microbead konumlandırmak için bıyık / kirpik aracını kullanın. Not: iyileşene kadar microbead embriyo ihraç olmayacak şekilde kesi sitesinden uzak dokuya microbead konumlandırmak için emin olun. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Geçtiğimiz yüzyılda, vücut planı desen ve organogenez anlayışı anıtsal gelişmeler uğramıştır. Doku manipülasyon teknikleri bu hayati süreçler hakkında önemli bilgiler açığa çıkarmak kritik idi. Genetik modifikasyonlar gen fonksiyonu tespit etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biri, ve bu hücre transplantasyonu olarak mozaik analiz yöntemleri, gen fonksiyonunun otonomisini anlamak için yararlı bir yaklaşım sağlarlar. Microbead implantasyon bu yöntem sinyal molekülleri veya inhibitörleri getirerek bir lokal doku ortamı değiştirmek için araştırmacı sağlayan olarak, gelişimsel dinamikleri nasıl değiştirdiğini belirli molekülleri sorgulamak için başka bir mekan sağlar. Farklı mikro bir dizi farklı boyutlar ve diğer fiziksel özellikler de ilgi deney koşulları için kullanılabilir, öyle ki (örneğin, şarj) mevcut olması, ticari olarak temin edilebilir. Böylece, bir protein veya kimyasal ıslatılır mikroboncuklar implanteBir organizmanın içinde ilgi cal, araştırmacılar gelişim sırasında lokalize etkilerinin araştırılması ve gen veya ilgi ve özellikle biyolojik fenotip (ler) molekülü arasındaki ilişkiyi bulabilirsiniz. Böyle zebrabalıkları 23 ön neurocranium (ANC) iskelet yapısının artan Kirpi sinyalizasyon etkisini değerlendirmek amacıyla microbead implantasyonu kullanılan Wada tarafından gerçekleştirilen bir ve meslektaşları olarak çalışmalar. Önceki çalışmalar, Shh ANC formasyonu 14 için gerekli olduğunu göstermiştir. Kullanımı Şşş kaplı mikroboncuklar araştırmacılar bu sinyal DÖB kıkırdak oluşumunu teşvik ettiğini belirledi. microbead implantasyon işlemi DÖB Kirpi sinyalizasyon ve kıkırdak oluşumu arasında açık bir bağlantı göstermek için kullanılmıştır. Bilim adamları eritroblastom Yirmi altı transkripsiyonel kontrol araştırdık nerede zebrafish bu doku manipülasyonu tekniğinin bir diğer önemli örnek çalışmalarda gözlenmiştir (ETS) etki faktörler ETS ilgili molekül (Erm) ve erken zebrabalıkları beyin gelişimi 19 sırasında FGF sinyalizasyon tarafından Polyoma arttırıcı aktivatör 3 (Pea3). Microbead implantasyon deneyleri sayesinde, onlar FGF8 ve Fgf3 ektopik erm ve Pea3 ifadesini aktive göstermek başardık. Bu örnekler, gen ekspresyonunu değerlendirmek için 41 yöntemleri ile iyi karakterize edilebilir, doku oluşumu sırasında işbirliği gelişim mekanizma içine anlayış sağlamak için mikro yararını göstermektedir. Böylece, microbead nakli gibi böbrek yol açan orta mezoderm (IM) gibi diğer dokuları, keşfetmek için uygun bir yöntem olabilir. Özellikle, nefron 42 segmentasyon ve 43,44, sadece yüzeysel şu anda anlaşılan süreçler tubulogenesis nasıl etkilediğini farklı moleküller araştırmak için, böbrek gelişim çalışmalarında yardımcı olacaktır. Ayrıca, microbead implantasyonu damızlık için kullanılmaya başlanmıştır ettizebrabalıkları 29] ve y rejenerasyon işlemleri gibi karşılık gelen yetişkin yapılarıyla araştırma yapmak için formüle edilmiştir yöntemlerle nefron 45 veya bağlantılı olduğu gibi, embriyonik doku takiben lazer ablasyonu gibi, organ yenilenmesi model, herhangi bir sayı ile kullanılmak üzere adapte edilebilir 46-49. Son olarak, mikroboncuk implantasyon kanser 50,51 veya doku dejenerasyonu 52,53 insan hastalık modelleri, kullanılmak üzere bir potansiyele sahiptir. Mevcut protokolde, biz de benzer şekilde, diğer araştırmacılar tarafından açıklanan, ancak video protokolleri 1 ile gösterilmeyen olmuştur Zebra balığı embriyolarının microbead implantasyonu, yöntemini göstermektedir. Minimal uygulama ile biz araştırmacı bazı tecrübeye sahip bir zamanlar bu prosedürün fizibilitesini ilgilidir 8-10 embriyoların yaklaşık oranı / saat, en mikroboncukları implant başardık. Burada gösterilen sonuçlar, çeşitli d o boncuk göstermektedirimensions erken dönemde implante edilebilir ve dikkatle ki bu doku manipülasyonu tekniği embriyo minimal fiziksel bozulma ile uygulanabilir. Vurgulanmalıdır Bir gelişme embriyo mikroboncuk konumlandırmak için bir bıyık / kirpik aracının kullanılmasıdır. Bu ekipman nispeten ucuz ve basit parça mikroboncuk aynı çapta hakkında elde etmek kolaydır ve implantasyon sürecini hızlandırmak yardımcı olur. bıyık / kirpik araştırmacı el becerisi ve tercihine bağlı olarak, henüz narin boncuk işleme aracı bir firma üretmek için istenen uzunlukta kesilebilir. Burada fiziksel implantasyonu gerçekleştirmek için mikroboncukları ve zebra balığı embriyolar işlemek için nasıl tarif ederken son olarak, bu protokol, farklı ilaçlar veya peptidler için özel taşıma prosedürleri anahat değildir. Genel olarak, kimyasal işlem görmüş mikro-organizmanın başka alanlarda istenmeyen etkileri engellemek için, çıkar olan hayvana implante edilmesi gerekir, ve araştırmacılar de olmalıdırçalışmalarını başlatmadan önce bu tür kimyasallarla ilişkili olası güvenlik kaygıları hakkında kurdu. Sonuç olarak, biz laboratuarda kolayca bulunabilen başlangıç ​​malzemeleri kullanılarak, geniş bir uygulama yelpazesi ile nispeten basit ve etkili bir mikroküre implantasyon yöntemi gösterilmiştir. Sonuçta, biz bu kılavuz Zebra balığı doku manipülasyonu hassas doğası ile araştırmacıların yardımcı olacağını umuyoruz.

Gelişim biyolojisi araştırmacılar, bir organizmanın nasıl oluştuğunu kontrol eden mekanizmaları ortaya çıkarmak için, hücresel, moleküler ve genetik yöntemlerle geniş bir dizi kullanmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında, doku manipülasyonu hücre kaderi, hücresel hareketi ve dokuların organizasyonu konusunda karmaşık soruları çözmekte önemli bir araçtır. Lokal doku ortamları değiştirmek için bir yolu, protein ya da diğer sinyal molekülleri 1 odak kaynağı sağlamak için kullanılan mikro-cerrahi uygulanması yoluyla. Deneysel manipülasyon Bu tip yaygın tür kurbağa ve civciv 2 gibi klasik omurgalı embriyoloji modelleri, uygulamaya konmuştur. Zebra balığı organogenez çalışma için önemli bir omurgalı bir model organizma haline ve insanlarda 6 yüksek genetik koruma payı olarak da hastalık modelleme 3-5 birçok benzersiz avantajlar sağlamaktadır etti. Özellikle, optik saydamlık ve eskiZebra balığı embriyonun gelişim modu, harici doku ontogeny 3-5 gözlem için eşsiz bir bakış açısı sunuyor. Büyük ölçekli ileri genetik ekranlar uygulanması daha fazla çalışma 7,8 ve verimli bir şekilde tek bir laboratuarlarda 9,10 azaltılmış ölçekte gerçekleştirilebilir Alternatif tarama teknikleri tanımlanması için zebra balığı mutant güçlü bir depo üretti. Daha fazla zebrabalıkları ile deneysel çalışmalar transgenik metodolojiler gelişmelere yoluyla kolaylaştırılabilir ve genetik yaklaşımlar 11,12 yanı sıra kimyasal genetik 13-15 tersine olmuştur. Bu tür mikro uygulanması gibi doku manipülasyon teknikleri yaygın zebrafish istihdam olarak, ama yine de daha da geliştirilmesi sırasında hücre sinyallerini anlamak için yararlı bir araç sağlamak değil. Microbead implantasyon zebra balığı retinada organ oluşumu süreçlerini sorgulamak için kullanılmıştır16,17 kalp 18, beyin 19-22, nöral krest 23 ve 24,25 fin. Bu ve diğer çalışmalarda, boncuk geçişlerini hücre göçü 27 ve eksenel desenlendirme 28 nasıl etkilediğini sinyal molekülleri 26 difüzyonunu anlamak için gelişim sırasında uygulanmıştır. Daha yakın zamanda, mikro-zebra balığı yetişkin 29 yenilenmesi mekanizmaları değerlendirmek için kullanılmıştır. Gelişimsel çalışmalarda, örneğin, Zebra balığı microbead çalışmaları göğüs yüzgeci 25 çalışmalarla bacak oluşum mekanizmalarına anlayışlar sağladı. Zebra balığı göğüs yüzgeci tomurcuk fare, 30 ve civciv 31&#39;inde ön ayakları tomurcuk homolog olduğunu. Omurgalı bacak tomurcuk iki temel sinyal düğümleri vardır: kutuplaştırıcı aktivite Sonic dikenli ifadesi ile ön-to-arka eksen kurar (ZPA) (Shh) ve mansap Hox gen hedeflerinin bölge,ve fibroblast büyüme faktörünün ekspresyonu (FGF&#39;ler) vasıtasıyla kolun distal kimliğine proksimal kurmak için hareket bacak tomurcuk, ucunda mevcut apikal, ektodermal bir sırtın (AER). zebrabalıkları Shh genetik mutantlar, araştırmacılar içine FGF batırılmış mikroboncukları implante Omurgalı uzvun 25 hücre döngüsünün ve büyüme ilerlemesi için gerekli olduğu FGF belirledi. Buna ek olarak Konumsal kimlik oluşturmak FGF ve Shh sinyalizasyon kaskadlar, kimlik 32 posterior anterior kurmak için kutuplaştırıcı bölgenin eylem taklit ederek molekül olarak retinoik asit (RA) tespit civciv bacak tomurcuk kullanarak öncü çalışmalar. Civciv bacak içine RA-batırılmış whatman küçük kağıt parçaları konur katılan Bu deneyler haneli desenlendirme 32 değerlendirmek için. Bundan başka, araştırmacılar, mikro kullanımını kullanan diğer şık çalışma yapmıştır, hücre transplantasyonu ve eksojenZebra balığı RA RA tedavileri Zebra balığı Beyin ve mezoderm 28 içinde uzun menzilli pozisyonel ipuçları sağlamak için hareket ettiğini tespit etmek. Ancak, şu anda birçok soru omurgalı gelişme birçok açıdan sırasında FGF ve RA gibi faktörlerin sinyal rolleri hakkında kalır. RA sinyal etkisi, bir morfogen gibi davranan, böyle RA proksimal böbrek hücreleri kaderlerini 35-39 tip belirten gelişen kalp ve böbrek 34 atalarıdır gibi pek çok organı 33, darbe. Bu tür konuların daha iyi anlaşılması doku manipülasyon ve microbead implantasyon teknikleri kullanılarak deneysel çalışmalar önemli ölçüde yarar olabilir. Civciv gibi modellere kıyasla daha az çalışma Zebra balığı, içinde microbead implantasyonu ile yapılmıştır ederken, yürütülen edilmiş olanlar son derece bilgilendirici olmuştur. Zebra balığı embriyo microbead implantasyon esaslı araştırma azlığı bir nedeni likel olduğunuy bir engel başarıyla tür manipülasyonlar gerçekleştirmeden oluşturan embriyonun büyüklüğü dayalı, zor teknik zorluklar var olduğu fikri. Ancak, Zebra balığı embriyolar microbead implantasyon uygulaması ile öğrenilen ve tekniğin görsel gözlem yoluyla yardım ve böylece kalkınma mekanizmaları sorgulamak için bir araç olarak takip edilebilirler. Burada, doku oluşumu ve hücre morfogenez ilgili tahlillerde çeşitli iletilmesi için kullanılabilir zebra balığı embriyo, bir mikroboncuk kesin uygulama göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 Micropipette tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>Low Temperature Incubator</td><td>Fischer Scientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>Dimethly Sulfoxide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45-106 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>Microbeads (45 &amp;micro;m)</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Tweezer</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tube holder</td><td>Globe Scientific Inc.&amp;nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

Zebra balığı gelişimsel biyoloji ve hastalığın çalışma için değerli bir genetik model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Balığı insanlar dahil olmak üzere, diğer omurgalıların, hücresel, moleküler, fizyolojik süreçlerde yüksek genomik koruma derecesinin yanı sıra, benzerlikleri vardır. Erken ontogeny sırasında, Zebra balığı embriyolar araştırmacılar, basit bir stereomikroskop kullanılarak organogenez dinamiklerini görselleştirmek için izin optik şeffaftır. Microbead implantasyonu, yerel ortamlarında faktörlerin değiştirilmesi yoluyla doku manipülasyonu sağlayan bir yöntemdir. Bu araştırmacılar, gelişmekte olan embriyonun içindeki spesifik uzaysal ve zamansal noktada salgılanmış peptidler gibi ilgi konusu sinyal molekülleri, herhangi bir sayıda etkilerini tahlil sağlar. Burada, biz detay erken zebrabalıkları gelişimi sırasında manipüle ve implant boncuklar nasıl bir protokol.

Manipülasyon araçları çeşitli tipleri araştırma uygulamaları (Şekil 1), mikro-boncuklar için yararlıdır. Buna ek olarak, küçük kuyuları ile basit bir agaroz kalıp zamanında ve etkin bir şekilde (Şekil 1), bu deneyler gerçekleştirmek için hayati önem taşımaktadır Zebra balığı embriyo tutmak için kullanılabilir. Bir mikroboncuk implantasyonu araştırmacılar ilgi molekülü için spesifik bir eylem pencere dar sağlar mekansal bir konuma ve ilgili zamansal safhada gerçekleştirilebilir. Burada, tek mikroboncuklar kuyruk tomurcuk aşamasında Zebra balığı embriyolarının içine veya somitogenesis aşamaları (Şekil 3) sırasında daha sonra zaman noktalarında implante edildi. Tek başına Ringer çözeltisi ile çalkalandı iki farklı büyüklükteki mikro-boncukları, bu protokol gösteri (Şekil 3A, 3B ve 3C) kullanılmıştır. Herhangi bir konjuge yokluğunda bu microbead implantasyonuküçük moleküller boncuk implantasyonu Zebra balığı embriyo (Şekil 4) uygun gelişimi sırasında brüt morfolojik etkileri olmadan elde edilebileceğini göstermektedir. Deneyciler embriyo üzerinde bir tungsten iğne ile yapılan delinme deliğe microbead manevra zorluklar karşılaşabilirsiniz. Bir kez mikro iğne ile embriyo yerleştirilen mikroboncuk daha iyi yol tutuşu elde etmek için, bir bıyık / kirpik aracı kullanılabilir. Diğer doğal veya sentetik kirpik filamanlar (Şekil 1) kullanılabilir, ancak bu, doğal olarak kedi veya köpek bıyık döken ile hazırlanmış olabilir. Tungsten iğne veya bıyık aracı ile ya mikroboncuk bir nazik itme microbead kalıp Ringer çözeltisi içine batar görmelisiniz. Mikroboncuk kalıp içine batmış sonra eğer gerekiyorsa tungsten iğne kullanarak, büyük mesafelerde taşınması gereken ve bir kez embriyo tepesinde bir iğne ya da kıl aracı positio için kullanılabilirembriyonun içine microbead n. boncuk stabil dokuda konumlandırılmış kalacaktır olarak microbead implantasyon başarısı hemen bir stereomikroskopta görselleştirme yoluyla ölçülebilir. Zamanla boncuk konumunu değerlendirmek için, her embriyo örnek canlı zaman kurs fotoğraf yoluyla görüntülü olabilir ya da (Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi) boncuk konum nedeniyle endojen doku deney süresi boyunca kaymıştır değil emin olmak için periyodik aralıklarla kontrol morfogenez. Zamanla boncuk konumunu anlama bir hedef doku veya gelişim süreci, küçük bir molekül etkisini değerlendirmek olarak sonuç, en iyi şekilde bilinçli yorumlanması için kritik önem taşır. Bu yukarıdaki adımların kullanılması istenen zamanda ve konumda zebrafish embriyo içine mikroboncukları imbed etmek için ideal bir ortam sağlayacaktır. Bizim tecrübelerimize göre, bu microbead implantasyon protokolünün acemi kullanıcılar genellikle beceri NE kazandıUygulamada yaklaşık bir hafta sonra tek Zebra balığı embriyo içine mikro tutarlı cerrahi implantasyon gerçekleştirmek için cessary. <img alt="Figür 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Şekil 1. Araçlar microbead implantasyonu gerçekleştirmek için kullanılır. (A) boncuk implantasyonu tepsi (sol, 15 cm çapında) embriyo kalıpları ile (solda) ve microbead kuluçka tepsi (sağda, 6 cm çapında). Bu çalışma tepsi araştırmacı microbead implantasyonu için istenen yönelim içine embriyolar yerleştirmek ve mikroskop istasyonunda yakın implantasyon için hazırlanan mikroboncukları sahip sağlar. Mikro-küreler, küçük molekül (ler) ve / veya araç içinde bekletilir ve daha sonra bir mikroskop istasyonunun altına yerleştirilmiş köşe implantasyon tepsisine yerleştirmeden önce, ayrı bir microbead plakasına (sağ) durulanmalıdır. (B), ince forseps iki çift chori kaldırmak için kullanılacakmicrocapillary iğnenin ucunu kırmak için ayrıca her Zebra balığı embriyo çevreleyen ve üzerinde. (C) tungsten iğne mikroboncuk konumlandırmak için zebrafish embriyo içine çok ince bir delik yapmak için istihdam edilecek. (D) microcapillary transferi pipet pick up ve delinme site yakınında Zebra balığı embriyonun üstünde bir microbead konumlandırmak için kullanılacaktır. (E) daha önce bir tungsten iğne ile yapılan embriyo içinde insizyon içine mikroboncuk nazik konumlandırma sağlayacak bıyık / kirpik aracı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Microbead implantasyon prosedürü Şekil 2. şematik. (A) mikro-soaki ile microbead implantasyon tepsisiİstenilen yıkama çözeltisi içinde ng bir stereomikroskopta istasyonu altında kurmak ve embriyolar doku yukarı bakacak şekilde konumlandırılmış. Tungsten iğne kullanarak (B), embriyo içine küçük bir kesi hafif ama güçlü hareketi ile yapılabilir. Bir microcapillary transfer pipet kullanarak (C), istenen microbead sağda bulunan tepsideki microbead kuluçka odasına aldım ve embriyo çalışma alanı yer almaktadır sol bölmeye getirilebilir. microbead insizyon yeri yakınlarında tevdi edilmelidir yavaşça bıyık / kirpik aracını kullanarak tungsten iğne ile yapılan kesi içine yerleştirilmiş. Bir microbead kesi içine manevra sonra, stabil microbead konumlandırmak ve gelişme devam ettikçe embriyo dışarı sonraki hareketini engellemek için (Ensizyondan uzak) doku içine sıkışmış edilmelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>kira bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Şekil 3. mikroboncukları farklı gelişim aşamalarında embriyolar implante edilebilir. (A) Zebra balığı embriyolar kuyruk tomurcuk aşamasında gövde içine mikroboncuk (yaklaşık 50 mikron çapında) yerleştirildi. 24 saat sonrası boncuk implant (hpbi) olarak incelendiğinde, embriyolar normal geliştiği ve microbead gelişimsel zamanın geçişi sırasında minimal hareketi gösterdi. 3 hücre gruplarının aşama (P) de sarısı kesesinin içine (yaklaşık 50 um&#39;lik bir çapa sahip) mikro implante (B) balığı embriyolar zaman içinde nispeten küçük bir kordon hareketiyle normal gelişimini göstermiştir. (C) daha büyük mikro-(yaklaşık 70 um çapında) benzer şekilde, normal sonraki gelişimini, yanısıra mini gösterdi 7 ss embriyo içerisine implante edildimal implantasyon siteden herhangi bir hareket. eğer <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Zebra balığı embriyo Şekil 4. Brüt gelişimi 72 hpbi ile mikroboncuk varlığı ile tedirgenmemis olan. Balığı embriyolar 7 hücre gruplarının aşaması (SS) (yaklaşık 50 um&#39;lik bir çapa sahip) Ringer çözeltisi içinde ıslatılmış mikro implante edildi. Her microbead cerrahi Somitlerin 3 ile 4 arasında, gövde içine sokulmuş boncuk varlığı 24 saat sonrası boncuk implant açık gelişimsel kusurlar (hpbi), 48 hpbi veya 72 hpbi ile ilişkili değildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.2K Görüntüleme.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Video: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Gelişim Biyolojisi

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Optik Tektum Gelişiminde Mikroglia Davranışının Aydınlatılması

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and function. Externally developing zebrafish embryos possess optical transparency, which along with well-characterized transgenic reporter lines that fluorescently label microglia, make zebrafish an ideal vertebrate model for such studies. In this paper, we take advantage of the unique features of the zebrafish model to visualize the dynamics of microglia cells in vivo and under physiological conditions. We use confocal microscopy to record a timelapse of microglia cells in the optic tectum of the zebrafish embryo and then, extract tracking data using the IMARIS 10.0 software to obtain the cells' migration path, mean speed, and distribution in the optic tectum at different developmental stages. This protocol can be a useful tool to elucidate the physiological significance of microglia behavior in various contexts, contributing to a deeper characterization of these highly motile cells.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Beyin Gelişimi Sırasında Mikroglia Göçünü Keşfetmek için Zebra Balığı Kullanma

We demonstrate a method that takes advantage of fast scanning confocal microscopy to perform live imaging of microglia cells in the developing zebrafish optic tectum, allowing for the analysis of the dynamics of these cells in vivo.

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Zebra balığı Embriyo microbead İmplantasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hücre içi bakteriyel patojenler ile Zebra balığı Embryolarının Enfeksiyon

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Zebra Balığı Embriyoları İçin Basit ve Etkili Bir Transplantasyon Cihazı

Optik Cımbız Kullanarak Hapsetmede Hücre Altı Mekaniğinin Doğrudan Kuvvet Ölçümleri

Bir zebra balığı embriyo Model In Vivo görselleştirme ve Staphylococcus aureus Intravital analiz Biomaterial ilişkili enfeksiyon

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Zebra Balığı Embriyosunda Mikroglia Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi ve Karakterizasyonu

Nöroinflamasyon ve Nörotoksisiteyi Değerlendirmek için Larva Zebra Balıklarına Lipopolisakkaritin Beyin Ventriküler Mikroenjeksiyonları