Otomatik Veri Toplama Yazılımı, biyolojik makromoleculess'ın yapısal karakterizasyonu için büyük miktarda kriyo verisi toplamak için son derece gereklidir. Otomatik Veri Toplama Yazılımı paketi, patojen biyolojisi ile doğrudan ilişkili olan çeşitli biyolojik makromoleculess'in yapısını karakterize etmek için kullanılmıştır. Örneğin, mikobakteri, HIV ve SASCO 2.
Başlangıç olarak, başlat menüsünden DigitalMicrograph'a tıklayarak Latitude-S Otomatik Veri Toplama Yazılımı'nı başlatın. Ardından, Teknik Yöneticisi'ni ve ardından Tek Parçacıklı Otomatik Veri Toplama için Latitude-S simgesini seçin. Önceki oturum ayarlarını temel alan bir oturum oluşturmak için, paletteki önceki oturuma göre onay kutusunu işaretleyin ve sonra yeni düğmeyi seçin veya varolan bir oturuma devam etmek için devam düğmesine basın.
Tamamen yeni bir oturum başlatmak için paletteki yeni sekmeye tıklayın. Devam edilecek oturumu içeren klasörü seçin ve verileri kaydetmek için klasörü seçin. Ardından, ayar simgesine tıklayın ve görüntülenen yönetilen durum araştırma kutusunda, durum ekleyin, TEM koşulu, kamera koşulu ve görüntü veya stok seçeneğini ayarlayın.
Ardından, kaydetme ayarlarını açmak için durumu adlandırın veya durum kurulum özetini açın. Ardından, Atlas durum paletine tıklayarak Atlas durumunu yapılandırın ve büyütme, aydınlatma koşulları ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın ve bir sonraki duruma geçmek için yanındakine tıklayın. Ardından ızgara durumu paletini tıklatarak ızgara durumunu yapılandırın, mikroskop görüntüleme optikleri, aydınlatma koşulları ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın ve sonrakine tıklayın.
Delik paletini tıklayarak delik durumunu yapılandırın ve görüntüleme optiklerini, aydınlatma koşullarını, binning ve kamera pozlama süresi parametrelerini ayarlayın. İleri'ye tıklayıp odak paletini tıklayarak bir sonraki odak durumunu yapılandırın ve görüntüleme optikleri, aydınlatma koşulları, binning ve kamera pozlama süresi için mikroskop ayarlarını yapın. Ardından deliğin yakınındaki amorf karbon alanına odaklanın ve bir sonraki duruma geçmek için yanındakine tıklayın.
Veri paletini tıklatarak veri durumunu yapılandırın ve mikroskop ayarları için parametreleri ayarlayın, sonra İleri'ye tıklayın. Verilen sekmede netleme değerlerinin aralığını ve adım boyutunu belirten odak yapılandırma paletine tıklayın ve sonraki adıma geçmek için sonraki düğmeye basın. Izgaradaki gerekli özelliklere odaklanın ve yakalama düğmesine tıklayın.
Ardından kırmızı çapraz işareti farklı durumların her görüntüsünde aynı unsura yerleştirin. Odak, Veri ve Delik durumları ile başlayın, çünkü görüş alanı Atlas ve Grid durumlarından daha büyüktür. Ardından, kırmızı çapraz işareti aynı özelliğe konumlandırmak için Atlas ve Grid durumlarını yakınlaştırın.
Beş farklı durum arasındaki konumları ve uzaklığı hesaplamak ve pozisyonları ve uzaklıkları çıktı penceresine yansıtmak için hesapla düğmesini tıklatın. Yakalama paletine tıklayın ve gereksinime göre ızgaranın tamamını veya bir kısmını kapsayacak şekilde Atlas'ın boyutunu seçin. Atlas'ı yakalamak için Atlas'ta gezinin ve buz kalınlığına göre ızgara karesini seçin.
İstediğiniz ızgara kareleri seçildikten sonra, zamanlama düğmesine tıklayın ve her ızgara karesi yakalanırken ızgara karesindeki döşemelerin dolduğunu gözlemleyin. Zamanlama düğmesi tıklatıldıktan sonra, deliğin konumunu ekleyerek ızgara karesinde temsili bir delik seçin. Delik görüntüsü alındıktan sonra, veri ve odak konumlarını tanımlayın ve düzeni şablon olarak kaydedin.
Otomatik bul'a tıklayın, delik boyutunu girin ve çapına göre delikleri otomatik olarak bulmak için programdaki bul düğmesine tıklayın. Izgara karesinden delikleri ve buz kirlenmesini gidermek için yoğunluğu ayarlayın. Otomatik bul aracılığıyla seçilen ve sarı işaret araçlarını ekledikten sonra enlem görevlerinde zamanlama düğmesine tıklayın.
CISTEM yazılımı kullanılarak hareket düzeltilmiş mikrografların ilk manuel taramasına göre, verilerin çoğunun istenen sinyal aralığında olduğu bulunmuştur. Ayrıca, defocus aralıklarında toplanan görüntüler de cisTEM tarafından manuel olarak kontrol edildi. Başak parçacıkları, yapısal görselleştirme için 2D sınıf ortalamalarını hesaplamak için manuel olarak seçildi, bu da şiddetle önerildi, ancak ilgili veri kümesi kullanılarak yüksek çözünürlüklü yapısal karakterizasyon mümkün oldu.
3D sınıflandırması, Spike Protein'in yukarı açık onayda 1RBD'ye ve aşağı yakın onayda diğer tüm RBD'ye sahip olduğunu gösterdi. Spike Proteininin 1RBD açık onayları C1 simetrisi kullanılarak yeniden inşa edildi. Spike Protein haritası yan üst ve alt görünümlerde temsil edilir.
Ve EM haritası, yan zincirlerin daha iyi görselleştirilmesi için atomik yapı ile donatılmıştır. RBD aşağı yakın onayları C3 simetrisi ve gösterildiği gibi atomik yapı ile donatılmış çivi 3D rafine model ve EM haritası ile rafine edilmiştir. Ve S2 alt alanı olarak tanımlanan Spike Proteininin ara onayı, bireysel amino asit kalıntılarının yan zincirlerini gösteriyordu.
Sonuçlar, Latitude-S'in biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü cryo EM verilerini toplayabileceğini öne sürdü. Bu Otomatik Veri Toplama Yazılımı, verileri otomatik olarak toplamak için başka herhangi bir elektron mikroskopi sistemi için kullanılabilir.
