Biz onun verimli görüş ve önerileriniz için Dr Yves L. Janin teşekkür ederim. Biz onu teknik destek için CHIK / Ren ve C. Combredet HH Gad teşekkür etmek istiyorum. Pasteur İlletler Infectieuses (POV&#39;un için Program Sting ve HM-- Bu çalışma Institut Pasteur, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale (INSERM), Institut Carnot tarafından desteklenen L), Agence Nationale la Recherche POV&#39;un için (ANR-RPIB, Program STING 2.0) ve &quot;Conseil Régional d&#39;Ile-de-France&quot; (Kimyasal Kütüphane Projesi dökmek, hibe n I 06-222 / R ° ve ben HM-L 09-1739 / R.). CHIKV / Ren üzerindeki çalışmalar proje ArbOAS tarafından desteklenmiştir (ANR hibe 2010-INTB-1601-02).

Bileşikler ile 96 oyuklu kızı Plakaların 1. Hazırlanması <ol><li> Oda sıcaklığına kadar -20 ° C DMSO kimyasal bileşiklerin 10 mM stok çözeltileri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar ana hareket ettirin. Seyreltik bileşikler, 2 mM&#39;de orta 96 oyuklu plakalar seyreltme elde etmek üzere DMSO içinde 5 kat. Seyreltme DMSO içinde 20 ul içine 5 ul pipetleme ve karıştırılarak elde edilir. </li><li> Pipet beyaz, bar kodlu doku kültürü, 96 oyuklu plakaların kuru kuyu içine seyreltme plakalarından 1 ul. Kız plakalar (D1) bu ilk set 20 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılacaktır. -20 ° C&#39;de kullanıma kadar saklayın kızı plakalar. </li><li> DMSO ve karıştırma 36 ul halinde seyreltme plakalarından 4 ul pipetleme ile yeniden bileşikleri 1:10 seyreltin. Beyaz, düz dipli, bar kodlu doku kültürü 96-kuyu tabak kuru kuyu içine Pipet 1 ul. Kız plakalar (D2) bu ikinci grubu PD replicatio inhibisyonunu değerlendirmek için kullanılacaktır2 uM nihai konsantrasyonda bileşiklerle n. -20 ° C&#39;de kullanıma kadar saklayın kızı plakalar. </li></ol> 2.. Hücre Kültürlerinin Hazırlanması Bileşik toksisitesini belirlemek için <ol><li> 37 ° C&#39;de HEK-293T hücrelerin büyümesine ve% 5 CO2 Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde stabilize L-glutamin ve% 10 fetal buzağı serumu (FCS), streptomisin (100 ug / ml) ve penisilin (100 ile IU / ml). Hücreler, her 4-5 gün tripsinizasyon ile geçişli ve yeni bir şişe içine 1:10 seyreltilir. Hücreler, deney için log fazında olmalıdır. </li><li> Deney gününde, hücreler tripsinizasyon ile geri ve hücre sayımı gerçekleştirin. Pelet santrifüj ile hücreler ve kültür ortamı içinde 3 x 10 5 hücre / ml &#39;de tekrar süspansiyon bunları. Hücre süspansiyonu 12.5 ml, her tarama plakası için gerekli olduğunu göz önünde bulundurun. </li><li> Transfer oluğuna hücreleri ve kirpi kimyasal alçı ihtiva eden D1 plakalar içinde hücre süspansiyonu 100 ul dağıtmakunds. Oluk içinde hücre süspansiyonu düzenli tortulaşmayı önlemek için karıştırılır. </li><li> 1 ul DMSO ile kontrol kuyuları A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 ve G12 başak. Karşılık gelen kuyu canlı hücreler için bir referans (toksisite) olarak kullanılacaktır. Kontrol kuyuları B1 başak, D1, F1, H1, 1 ul DMSO ve hücreleri öldürmek için bir 0.5% IGEPAL çözeltisi 2.5 ul B12, D12, F12 ve H12. Karşılık gelen kuyu ölü hücreleri için bir referans (yüksek toksisite) olarak kullanılacaktır. </li><li> 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca inkübe edin ve hücreleri,% 5 CO2. </li></ol> RMV2/Luc tarafından enfekte Hücre Kültürleri 3. Hazırlanması <ol><li> Büyüme ve 2.1 ve 2.2 &#39;de açıklandığı gibi hücreleri kurtarmak. Yine, kültür ortamı içinde 3 x 10 5 hücre / ml &#39;de tekrar süspansiyon hücreleri. Hücre süspansiyonu 12.5 ml, her tarama plakası için gerekli olduğunu göz önünde bulundurun. </li><li> İsteğe bağlı: 20 ug / ml &#39;de ek üridin ile kültür ortamı. Not: viral replicatio için kimyasal kütüphanelerinin taranması zamann inhibitörleri, bu pirimidin biyosentez yolunun erken aşamaları hedefleme bileşikleri sık sık 13,16,27,28 izole gibi görünüyor. Kültür ortamına üridinin ilavesi gibi antiviral molekülleri filtrelemek için kullanılır. Gerçekten de, bu etkin bir pirimidin biyosentez yolunun üst enzimler engellenir viral replikasyonu yükler. </li><li> Enfekte edilmemiş hücreler ile kontrol kuyuları için hücre süspansiyonu 01:10 to ve kalan hacmi ile enfeksiyon geçin. </li><li> RMV2/Luc stok çözeltinin uygun hacmi çözülme. MV stok solüsyonları ml başına 10 6 -10 8 enfeksiyöz partiküller genellikle. Kültür enfeksiyon (MOI) 0.1 çokluğu karşılık gelen hedef hücre başına rMV2/Luc 0.1 bulaşıcı parçacıklar, ile enfekte olması gerekir. Not: rMV2/Luc PD aşısı (Schwarz suşu) elde edilir ve bir BSL2 ortamda değiştirilebilir. </li><li> Hücre süspansiyonu virüs ekleyin ve hafifçe karıştırın. Bir çukur enfekte hücreleri aktarın ve 100 dağıtmaksütun 2 çivili kimyasal bileşikleri ihtiva eden D2 plakaları 11 olarak enfekte edilmiş hücre süspansiyonu ul. Oluk içinde hücre süspansiyonu düzenli yavaşça karıştırılır. </li><li> Sütun 1 ve 12&#39;de, 100 non-enfeksiyonlu hücrelerin ul iyi olarak iki tane dağıtmak. Enfekte hücreler, diğerleri kuyularda dağıtılır. </li><li> 37 ° C&#39;de 24 saat boyunca inkübe edin ve hücreleri,% 5 CO2. </li></ol> 4. Lüsiferaz Aktivite Önlemleri ve Veri Analizi <ol><li> Inkübatörden D1 plakaları çıkarın ve doğrudan kültür çukurlarına lusiferaz tabanlı canlılığı maddesi 50 ul eklenmesi ile hücre canlılığı belirler. Karıştırınız ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edilir. Bir lüminometre ile plakaları okuyun. Entegrasyon zamanı kuyunun başına 100 milisaniye olarak belirlenmiştir. </li><li> Inkübatörden D2 plakaları çıkarın ve doğrudan kültür çukurlarına lusiferaz alt-tabaka, 50 ul ekleyerek lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca inkübe edin ve anlatıldığı şekilde bir lüminometre ile plakaları okuYukarıdaki yatak. </li><li> Ekranın 29 kalitesini garanti etmek için toksisite deneyi her bir D1 bir plaka için Z&#39;-faktörü hesaplanır. Μ + ve σ + yalnız DMSO ile HEK-293T hücreleri için parlaklık ve standart sapmalar (toksisite) vasıtasıyla tekabül - (μ-, Z &#39;= 1-3 * (σ + + σ-) / μ +) ve μ-ve ışık yayılımı ve hücrelerini öldürmek için Igepal işlemden kültür çukurlarına için standart sapma anlamına gelir σ-bulunmaktadır. Z &#39;, 0.5&#39; in yukarısında olması beklenen, veya karşılık gelen plaka atılır. </li><li> Μ + / 2 toksisite eşiğini ayarlayın. Bu cut-off (Şekil 3A) altında ışıldama değerleri ile bileşikler atın. </li><li> Antiviral tahlil D2 her bir plaka için Z&#39;-faktörü hesaplanır. Burada, μ + ve σ + yalnız DMSO ile enfekte kültürlenmiş hücreler için parlaklık ve standart sapmaların araçlarına karşılık gelir ve μ-ve enfekte olmayan hücreler için parlaklık ve standart sapmaları araçları σ-bulunmaktadır. Yine, Z &amp; # ile plakaları39; 0,5 altındaki değerler de göz ardı edilir. </li><li> - / (Μ + - μ-) x 100 = (bileşik X lusiferaz aktivitesi μ +) inhibisyon yüzdesi: aşağıdaki gibi viral replikasyonun inhibisyonunu hesaplayın. % 75 inhibisyon eşik ayarlayın, hem de bu cut-off (Şekil 3B) altında ışıldama değerlerini azaltmak ve 4.4 açıklanan kriterlere göre toksik olmayan bileşikler seçin. </li></ol> Toksisite ve Geniş spektrumlu Antiviral Aktivite 5. İkincil Ekran <ol><li> Her biri için 1:2 dizi sulandırmalar 500 uM 4 uM (8 seyreltme) başlanarak DMSO içerisinde bileşik isabet olun. Kültür ortamında 50 ul ile beyaz, bar kodlu doku kültürü plakaları doldurun. Kültür kuyularda Her bileşik seyreltmesinin 1 ul ekle. Her hit bileşik için çift seri seyreltileri ile 3 kültür plakaları iki kez tekrarlayın. </li><li> (Yukarıda tarif edildiği gibi kültür ortamı içerisinde 6 x 10 5 hücre / ml &#39;de bir HEK-293T hücre süspansiyonu hazırlamak 37.5 ml 2.1 ve 2.2). Falcon tüplerde 2x 12.5 ml dağıtın ve MOI&#39;da rMV2/Luc ile ya hücreleri enfekte = 0.1 ya da MOl&#39;de Renilla lusiferaz (CHIKV / Ren) ifade eden biraraya getiren CHIKV = 0.2. Ters çevirerek karıştırın. Not: CHIKV / Ren CHIKV bir vahşi tip suşu elde edilir ve bu nedenle bir BSL3 ortamda temas edilmelidir. Renilla alt-tabaka kültür çukurlarına eklenmiştir sonra levhalar (aşağıya bakınız) BSL1 için BSL3 taşınmış olabilir. </li><li> Hit bileşiklerinin seri seyreltmeleri içeren kültür plakaları içinde, enfekte olmamış rMV2/Luc-infected veya CHIKV / Ren-enfekte edilmiş hücreler, 50 ul koyun. 37 ° C&#39;de 24 saat inkübe </li><li> RMV2/Luc-infected kuyularda ateş böceği lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi için, ateş böceği lusiferaz alt-tabaka 50 ul ekle. CHIKV / Ren-enfekte kuyuda Renilla lusiferaz aktivitesinin belirlenmesi için Renilla lusiferaz alt-tabaka 50 ul ekle. Son olarak, hücre yaşayabilirliği belirlemek için, enfekte olmamış hücrelere lusiferaz tabanlı canlılığı tahlil maddesi 50 ul ekle. </li><li> Arsa veri (FiGüre 4) ve% 50 MV ve CHIKV çoğalmasını inhibe vurmak bileşik konsantrasyonları belirler. Bu deneyde bir toksisite gösteren bileşiği göz ardı. </li></ol>

<ol>
	<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+drugs+in+current+clinical+use.">Antiviral drugs in current clinical use.</a> J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).</li><li>Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervention+strategies+for+emerging+viruses:+use+of+antivirals.">Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals.</a> Curr Opin Virol. , (2013).</li><li>Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+to+inhibit+the+replication+of+RNA+viruses.">Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses.</a> Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).</li><li>Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predominant+mechanism+by+which+ribavirin+exerts+its+antiviral+activity+in+vitro+against+flaviviruses+and+paramyxoviruses+is+mediated+by+inhibition+of+IMP+dehydrogenase.">The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase.</a> J Virol. 79, 1943-1947 (2005).</li><li>Wang, B. X., Fish, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+viruses+and+interferons.">The yin and yang of viruses and interferons.</a> Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).</li><li>Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+advances+in+the+treatment+and+prevention+of+respiratory+syncytial+virus.">Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus.</a> Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).</li><li>Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+and+the+host+response+to+viral+infection.">Systems biology and the host response to viral infection.</a> Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).</li><li>Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Approaches+towards+the+Development+of+Host-Directed+Antiviral+Therapeutics.">Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics.</a> Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).</li><li>Connolly, D. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+Toll-like+receptor+targeted+therapeutics.">New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2012).</li><li>Thakur, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+activators+of+RNase+L+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).</li><li>Shoji-Kawata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+candidate+therapeutic+autophagy-inducing+peptide.">Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide.</a> Nature. 494, 201-206 (2013).</li><li>Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+analyst's+couch:+TLR-targeted+therapeutics.">From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).</li><li>Bonavia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+broad-spectrum+antiviral+compounds+and+assessment+of+the+druggability+of+their+target+for+efficacy+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).</li><li>Rider, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+therapeutics.">Broad-spectrum antiviral therapeutics.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Krumm, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+host-directed+small-molecule+inhibitors+of+myxovirus+RNA-dependent+RNA-polymerases.">Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases.</a> PLoS One. , (2011).</li><li>Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).</li><li>Harvey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK983:+a+novel+compound+with+broad-spectrum+antiviral+activity.">GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity.</a> Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).</li><li>Swinney, D. C., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+were+new+medicines+discovered.">How were new medicines discovered.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).</li><li>Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+high-throughput+screening+to+quantify+antiviral+activity+against+viruses+that+induce+limited+CPE.">A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE.</a> J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).</li><li>Puig-Basagoiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assays+using+a+luciferase-expressing+replicon,+virus-like+particles,+and+full-length+virus+for+West+Nile+virus+drug+discovery.">High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).</li><li>Panchal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+high-content+imaging+assays+for+lethal+viral+pathogens.">Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens.</a> J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).</li><li>Pohjala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+alphavirus+entry+and+replication+identified+with+a+stable+Chikungunya+replicon+cell+line+and+virus-based+assays.">Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening.">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).</li><li>Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+firefly+luciferase+and+other+bioluminescent+reporters+used+in+chemical+biology.">Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology.</a> Chem Biol. 17, 646-657 (2010).</li><li>Komarova, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+virus-host+interactions+in+an+infectious+context+using+recombinant+viruses.">Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses.</a> Mol Cell Proteomics. , (2011).</li><li>Henrik Gad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E2-E166K+substitution+restores+Chikungunya+virus+growth+in+OAS3+expressing+cells+by+acting+on+viral+entry.">The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry.</a> Virology. 434, 27-37 (2012).</li><li>Wang, Q. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dengue+virus+through+suppression+of+host+pyrimidine+biosynthesis.">Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis.</a> J Virol. 85, 6548-6556 (2011).</li><li>Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D282,+a+non-nucleoside+inhibitor+of+influenza+virus+infection+that+interferes+with+de+novo+pyrimidine+biosynthesis.">D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis.</a> Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Qing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+dengue+virus+resistance+to+brequinar+in+cell+culture.">Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).</li><li>Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+dihydroorotate+dehydrogenases+and+their+inhibitors+and+uses.">On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses.</a> J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).</li><li>Yoon, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening-based+identification+of+paramyxovirus+inhibitors.">High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors.</a> J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).</li><li>Mar&#233;chal, E., Roy, S., Lafanech&#232;re, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , (2011).</li><li>Gentzsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+complete+life+cycle+screen+for+identification+of+small+molecules+with+pro-+or+antiviral+activity.">Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity.</a> Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).</li><li>Caignard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V+protein+of+Tioman+virus+is+incapable+of+blocking+type+I+interferon+signaling+in+human+cells.">The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells.</a> PLoS One. 8, (2013).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan tarama hattı RNA virüslerinin geniş spektrumlu inhibitörleri olarak uygun bir profili olan bileşiklerin seçilmesi amaçlamaktadır. 10000 bileşiklerinin bir kütüphane bu protokol ve belirtilen kriterleri filtreleme uygulanmıştır ile tarandı zaman,% 75, 40 bileşikleri (% 0.4) daha üstün PD replikasyonunun inhibisyonu, yani pozitif attı. Bunun yanı sıra, bunların yaklaşık yarısı lusiferaz tabanlı canlılığı deneyde bir toksisite göstermiştir ve bu nedenle göz ard?...

RNA virüsleri, insan enfeksiyonlarına çok çeşitli sorumludur, hem halk sağlığı ve ekonomik maliyet açısından dünya nüfusu üzerinde büyük bir etkisi var. Etkin aşıların pek çok insan RNA virüslerine karşı geliştirilmiş ve yaygın olarak profilaktik tedavi olarak kullanılır. Ancak, RNA virüs enfeksiyonlarına karşı tedavi edici ilaçların önemli bir eksikliği var. Gerçekten de, verimli bir aşı, dang virüsü, Hepatit C virüsü ya da insan solunum sinsisyal virüsü (hRSV) gibi büyük, insan patojenlerine karşı mevcut değildir. Ayrıca, RNA virüsleri, çünkü küresel değişim ve ekolojik sistemler üzerindeki insan etkisi sıklığı arttı ortaya çıkan hastalıkların bir çoğunluğu sorumludur. RNA virüsleri temsil Bu tehdide karşı, bizim terapötik arsenal son derece sınırlı ve 1-3 nispeten verimsizdir. Mevcut tedaviler esas itibariyle, doğuştan bağışıklığı uyarmak için rekombinant tip I interferonlar (IFN-α / β) dayanmaktadırya da ribavirin yönetimi. Bu ribonükleosit analog etkime şekli tartışmalıdır ve muhtemelen çeşitli mekanizmalar kullanır, ancak, hücre içi GTP havuzları tüketen hücresel İMPDH (inosin monofosfat dehidrogenaz) inhibisyonu, 4 açıkça gereklidir. Ribavirin, pegile edilmiş IFN-α ile birlikte, Hepatit C virüsüne karşı ana tedavidir. De etkin bir şekilde küt IFN-α / β 5 hastalık oluşturma faktörleri sentezlenmesi yoluyla sinyal ve genellikle ribavirin 3 kaçış Ancak, IFN-α / β ve ribavirin tedavileri en RNA virüslerine karşı in vivo koşullarında nispeten zayıf bir etkiye sahiptir. Son zamanlarda tartışmalı yararları 6, ağır hRSV hastalığa karşı kabul edildi, ancak bu, önemli bir tedavi ribavirin toksisite sorunlar yaratmaktadır gerçeğine ilave edildi. Daha yakın zamanda, bir virüs özel tedaviler geliştirme o ile influenza virüsüne karşı, özellikle de pazarlanmıştırf nöraminidaz inhibitörleri 3. Ancak, büyük çeşitlilik ve RNA virüslerinin sürekli ortaya çıkması nispeten yakın bir gelecekte bunların her birine karşı özel tedavilerin gelişimini engellemektedir. Toplamda, bu yakın gelecekte güçlü antiviral molekülleri tanımlamak ve geliştirmek için etkili stratejiler için gereğini vurguluyor. Bu RNA virüslerinin büyük bir paneline karşı aktif, geniş spektrumlu inhibitörü, bu sorunu çözmek olacağını söylemek saçmadır. Böyle bir molekül hala Virolog rüyası olmasına rağmen, hücresel savunma mekanizmaları ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi bizim daha iyi anlaşılması bazı olasılıklar 7,8 var olduğunu göstermektedir. Çeşitli akademik ve endüstriyel laboratuarlar şimdi hücresel savunma mekanizmaları veya viral replikasyon künt metabolik yolların belirli yönlerini uyaran moleküller arıyorlar. Bu tür bileşikler, muhtemelen önemli yan etkiler gösterir, ancak akut viral enfeksiyonlara karşı işlemleri yapmak olacakuzun vadede bazı potansiyel toksisitesi rağmen onları kabul edilebilir hale, nispeten kısa bir süre için ed. Çeşitli stratejiler gibi geniş spektrumlu bir anti-viral molekülleri tanımlamak için geliştirilmiştir. Bazı araştırma programları belirli savunma veya metabolik yolları hedef molekülleri bulmayı hedefliyoruz. Bunlar arasında, örneğin, anti-viral gen ekspresyonu 9 ortaya çıkarmak ve bu RNaseL 10, virüs bozulma 11 desteklemek için autophagy makineleri gibi antiviral faktörleri aktif hale getirmek için bir patojen tanıma reseptörleri, nükleosid sentezi, virüs ile enfekte olmuş hücrelerin ölümünü çökeltmek için 12,13 veya apoptotik kaskadlar yolaklar 14. Diğer gruplar 13,15-17 hedef bazlı olmayan fenotipik ekranlar geliştirdik. Bu durumda, anti-viral moleküller sadece belirli bir hücresel sistemde viral replikasyonu bloke etme kapasitesi ile tanımlanır. Genel varsayım 2-3 olmayan RNA virüslerini inhibe eden bir bileşiği, bir geniş-sp için uygun bir profile sahip olduğunu ifade ettiantiviral molekülü ectrum. Bu tür bir yaklaşım ile seçilen ampirik hit bileşiklerin etki modu yalnızca ikinci kez tespit edilir ve sonunda, antiviraller için yeni hücre hedeflerin tanımlanmasına yol açabilir. İlginçtir, 1999 ve 2008 yılları arasında ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından onaylanan yeni ilaçların bir retrospektif analizi genel olarak, bu tür fenotipik gösterimleri birinci sınıfında küçük moleküllü ilaçlar 18 keşfetmek için hedef odaklı yaklaşımlar daha iyi performans eğiliminde olduğunu göstermiştir . , Yüksek yayılmalı hücre bazlı deneylerde Viral replikasyonu çoğunlukla virüs sitopatik etkiler belirlenir. Hücreler, enfekte edilmiş ve 96 içinde kültürlenir - ya da test edilen bileşiklerin mevcudiyetinde 384 oyuklu plakalar. Birkaç gün sonra, hücre katmanları sabittir ve bu kristal mor gibi boyalarla boyanmıştır. Son olarak, absorbans, bir plaka okuyucu ve viral replikasyonu inhibe edici bileşikleri, ileri hücre katmanları korumak için kapasiteleri ile tanımlanır belirlenirm virüs kaynaklı sitopatik etkiler. Seçenek olarak ise, viral kaynaklı sitopatik etkileri, MTS azaltılması gibi standart canlılığı tahliller kullanılarak değerlendirilir. Bu tür deneyler son derece uysal ve maliyet-etkili, ancak üç büyük sınırlamalar muzdarip. İlk olarak, böylece 19, alternatif yaklaşımlar çağrısında, viral replikasyonu sadece birkaç gün sitopatik, ancak bu her zaman mümkün değildir, bir virüs-hücre kombinasyonunu gerektirir. İkincisi, onlar viral replikasyon dolaylı ölçümüne dayalı olduğundan kötü nicel vardır. Son olarak, toksik bileşikler, pozitif sonuç olarak atılır ve bu nedenle hücre canlılığını ölçen bir sayaç ekranı olan giderilmelidir. Bu engel bazılarının üstesinden gelmek için, yeniden birleştirici virüs veya replikonlar ek transkripsiyon biriminden ya da viral protein gen (birkaç örnek 20-23 olan) ile aynı çerçevede, bu tür EGFP veya lusiferaz gibi haberci proteinleri ifade etmek için ters genetik mühendislik edilmiştir. Bu virüsleri çoğalmak, muhabir proteins viral proteinler kendileri ile birlikte üretilmektedir. Bu viral replikasyonu ölçmek ve Aday moleküllerin inhibitör aktivitesini değerlendirmek için, çok nicel analizi sağlar. Bu, raportör sistem, yüksek hassasiyet ve hemen hemen hiç arka plan ile bir geniş dinamik aralık sergiler Başlangıcı lusiferaz (ya da bio-ışıldamanın sahip başka enzimler) ifade eden rekombinant virüs için geçerlidir. Bundan başka, herhangi bir uyarı ışığı kaynağı, bileşik floresan 24 ile girişimi önleyen vardır. Burada ayrıntılı bir yüksek verimli bir protokol RNA virüslerinin geniş spektrumlu inhibitörleri için kimyasal kütüphanelerinin taranması için. Bileşikler, ateş böceği luciferase 25 (rMV2/Luc, Şekil 1, bir primer eleme) eksprese eden bir rekombinant kızamık virüsü (MV) ile enfekte edilmiş insan hücreleri üzerindeki ilk test edilmiştir. PD Mononegaviraller sınıfı, ve genellikle, negatif dallı RNA virüsü bir prototip üyesi olarak kabul edilires. Bu nedenle, MV genom viral proteinler için kodlayan mRNA moleküllerinin sentezlenmesi için viral polimeraz ile bir şablon olarak kullanılır. RMV2/Luc olarak adlandırılan, rekombinant MV suşu olarak, lüsiferaz ifadesi P ve M gen (Şekil 2A) arasında herhangi bir ek transkripsiyon biriminden ifade edilir. Buna paralel olarak, bileşikler, ATP miktarının ölçülmesi ile, değerlendiren bir ticari lusiferaz bazlı bir reaktif kullanılarak, insan hücreleri üzerindeki toksisite için test edilir, kültür içinde metabolik olarak aktif hücrelerin sayısı (Şekil 1, birinci ekranı). Bütün kimyasal kütüphaneler kolayca toksik olmayan ve etkili bir şekilde bloke eden bileşikler PD çoğaltma seçmek için bu iki deneyleri ile taranabilir. Daha sonra, bulgular, Chikungunya virüsü (CHIKV) çoğaltma (Şekil 1, ikinci ekranı) bozduğu kapasiteleri için doz-yanıt PD replikasyonun inhibisyonu, toksisite eksikliği yanı sıra için yeniden test edilir. CHIKV Togaviridae ailesinin bir üyesidir ve genom apOsitive tek iplikli RNA molekülü. Bu nedenle, kızamık ve OG ve CHIKV hem RNA virüslerinin büyük bir paneli engellemek için büyük bir şansı önleyici bileşiklerin tamamen ilgisiz olduğunu. Yapısal proteinler, transkripsiyon ve bir alt genomik mRNA molekülü tarafından kodlanan çeviri oysa CHIKV yapısal olmayan proteinleri, doğrudan viral genomundan çevrilir. CHIKV yönelik in vitro deney çoğaltma NSP3 ve NSP4 dizileri 26 (Şekil 2B) arasındaki raportör geninin bir sokma yoluyla yapısal olmayan poliproteinin bir parçası olarak yarılmış Renilla lusiferaz enzimi ifade CHIKV / Ren adı verilen bir rekombinant soyu dayanmaktadır. Renilla lusiferaz etkinliğinin ölçüsü CHIKV yaşam döngüsünün erken aşamasında viral replikasyonun izlenmesine olanak sağlar. Bu yüksek hızlı verimlilik protokol 10000 Molec ticari bir kütüphanede geniş spektrumlu antiviraller için uygun bir profili olan bileşiklerin belirlenmesi için kullanılmıştırModüller kimyasal çeşitliliği için zenginleştirilmiş. Bileşikler, esas olarak 250 ila 600 daltona kadar değişen molekül ağırlıkları olan, beş Lipinski kuralı ardından, 5 &#39;in altında ve D değerleri log edilmiştir., Bu moleküllerin pek çoğu, diğer ticari kütüphanelerde mevcut olmayan yeni bir kimyasal maddeler edildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="756">
	<colgroup>
		<col />
		<col /> 
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Freedom EVO platform</td>
			<td style="width:105px;">TECAN</td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:316px;">Robotic platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-Well Polystyrene Cell Culture Microplates, White</td>
			<td style="width:105px;">Greiner Bio One</td>
			<td style="width:119px;">655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">G7570</td>
			<td>Luciferase-based viability assay</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bright-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2610</td>
			<td>Reagent containing firefly luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Renilla-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2710</td>
			<td>Reagent containing Renilla luciferase substrate</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Britelite plus Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:105px;">Perkin-Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016761</td>
			<td style="width:316px;">Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput screening for broad-spectrum chemical inhibitors of rna viruses

RNA virüsleri gibi grip, bronşit, dang, Hepatit C ya da kızamık gibi önemli insan hastalıkları sorumludur. Ayrıca, çünkü daha doğal ekosistemlerin nüfuz artan dünya çapında değişim ve insan nüfusu yükselen bir tehdit oluşturuyor. Böyle yükselen bir duruma iyi bir örnek Hint Okyanusu&#39;nda 2005-2006 arasında chikungunya virüsü salgın olduğunu. Viral replikasyonu kontrol hücresel yolların anlayışımızda son gelişmeler konakçı hücre fonksiyonlarını hedefleme bileşikleri, daha doğrusu virüsün kendisinden daha, RNA virüsleri büyük bir panel inhibe olabileceğini düşündürmektedir. Bazı geniş spektrumlu antiviral bileşikler, ana hedef odaklı deneyleri ile tespit edilmiştir. Ancak, hücre kültürlerinde viral replikasyonun inhibisyonunu ölçen bir gösterge olarak sitopatik etkileri azaltma kullanarak yine çok önemli bir tarama stratejisi temsil eder. Bu gibi fonksiyonel ekranlar çok raportör ifade eden rekombinant virüslerin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir ca enzimlerilüsiferaz gibi bio-ışıldamanın palpe edilebilir. Bu raporda, ayrıntılı bir geniş spektrumlu anti-viral profili olan bileşikleri tespit etmek, yeniden birleştirici kızamık ve hücre canlılığı deneyleri ile Chikungunya virüs birleştiren bir yüksek verimli tarama boru hattı.

Bu tarama hattı PD çoğalmasını önleyen bileşiklerin seçimi ilk dayanır ve önemli bir hücresel toksisite (Şekil 1, birinci ekranı) göstermezler. Bu, hücre toksisitesi ve viral replikasyonun inhibisyonunu belirlemek üzere lusiferaz bazlı deneylerde yararlanır. Tüm adımlar, pipetleme ve veri toplama bir robot platform ile, bir yüksek verimli bir ortamda gerçekleştirilebilir. Bileşiklerin hücresel toksisite, metabolik olarak aktif hücrelerin karşılık...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses at JoVE.com

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

high-throughput-screening-for-broad-spectrum-chemical-inhibitors-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K Görüntüleme.  Institut Pasteur, CNRS UMR3569.  Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını. 

Video: High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Bakteriyel Kalıcılık Üzerindeki Etkilerini Aydınlatacak Kimyasal Bileşiklerin Yüksek Verimli Taranmasını

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...