The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Ab&#250;ndez, Jes&#250;s Padilla-Calder&#243;n, Jaime M. Uribe-Wiechers, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.

Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> BGE çözüm hazırlayın. <ol><li> % 0.05 oluşan bir çözelti 100 ml hazırlanması (kütle / hacim) hidroksi propil metil selüloz (HPMC), 200 mM ε-amino, n-kaproik asit (EACA) ve 30 mM lityum asetat. Not: HPMC viskoelastik bir polimer olduğu için, bir cam beher içine toz dökün su 80 ml ilave edilir ve son olarak da karıştırma çubuğu ilave edin. normalde kalan reaktif eklemeye devam edin. o göz tahrişine neden olabilir lityum asetat işlerken güvenlik gözlükleri takın. </li><li> % 50 (hac / hac) asetik asit ile 4.8 ± 0.1 pH değerine ayarlar. Çözelti 5 dakika için stabilize etmek ve gerekli ayarlamak için izin ver. </li><li> volümetrik bir şişede 100 ml&#39;lik nihai hacme kadar telafi etmek için su ilave edilir. </li><li> 0.2 um&#39;lik bir gözenek büyüklüğüne sahip bir hidrofilik zardan geçirerek filtre et. </li><li> 7 güne kadar 2-8 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Iç standart hazırlayın. <ol><li> 1 mL hazırlayın% 1 (m / v) histamin oluşan bir çözelti. </li><li> 0.2 um&#39;lik bir gözenek büyüklüğüne sahip bir hidrofilik zardan geçirerek filtre et. </li><li> kadar 1 gün 2-8 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Numune Hazırlama <ol><li> 1 mg / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar Tris tamponu (50 mM tris (hidroksimetil) aminometan pH 8.0) ile seyreltildi mAb örnek 180 ul hazırlayın. </li><li> % 1 (m / v) histamin 20 ul ekle. </li><li> Mix ve 5 saniye boyunca 1.000 xg&#39;de santrifüj. </li><li> evrensel bir şişe içinde bir mikro şişe yerleştirin. </li><li> Mikro şişenin içine örnek aktarmak ve evrensel şişe kapağı. Herhangi kabarcıkları tanıtan önlemek için yukarı doğru örnek dağıtın. </li><li> kadar 1 gün 2-8 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Numune giriş tepsisine (örnek çözeltisi içeren flakon mikro) ile evrensel flakon yerleştirin. </li></ol> CE sistemi 3. hazırlanması. <ol><li> CE sistem temizleme. NOT: Davranış inciToz ve döküntü birikiminin elde edilen elektrik akımı sızıntısını önlemek için en az bir kez bir hafta işlemdir. Bununla birlikte uygulamaya bağlı olarak (örneğin, artan viskozitesi ile ya da yüksek tuz konsantrasyonu, artan viskozitesi ile örnekleri ile BGE kullanılması) elektrot ve açma kolu çapraz kontaminasyonu ve örnek taşınmasını önlemek için daha sık temizlenmesi gerekebilir. <ol><li> CE cihazının güç düğmesini kapatın ve ön kapağı açın. </li><li> suya batırılmış dokunmamış silme ile, örnek tutan sistemi (örnek ve tampon tepsiler), kartuş kapağını, kelepçe bar, arayüz bloğu ve elektrotları numune örtüsünün yüzeyini temizleyin. ile işlemi tekrarlayın bir etanol-nemlendirilmiş silin ve kullanımdan önce kuru. </li><li> su ile iyice açarak kollarını durulayın. bir dokunmamış silme ile yüzeyini temizleyin. ile işlemi tekrarlayın bir etanol-nemlendirilmiş silme ve kurulumdan önce kuru. </li><li> Dikkatli bir fiber optik kablonun iki ucu temizlemesuyla nemlendirilmiş mikrofiber bezle ly. Etanol-nemlendirilmiş bir bezle işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Kartuş montaj. <ol><li> paketinden yeni bir nötr kılcal (50 mikron iç çapı) çıkarın. </li><li> Teyp tezgah kılcal koruyucu boru bir ucunda aşağı. , Uncoil düzeltmek ve tüp dışarı kılcal çekin. </li><li> Tezgahında için bant veya bir kağıt parçası sopa ve aşağıda ölçüm işaretleri ekleyin: uzunluk detektörü (30 cm), çıkış ucuna kılcal penceresi (0.2 cm) uzunlukta (10 sm) (yani, 40.2 cm toplam uzunluğu, 30.0 cm efektif uzunluk). </li><li> Referans kağıt 0.2 cm ölçüm işaretine kılcal penceresini hizalayın. bant ile kılcal düzeltmek ve kılcal ölçüm işaretleri dışında 2 mm biter işaretleyin. </li><li> yarma taş floş kenarını kullanarak tek bir düz harekette kılcal giriş ucunda koruyucu kapağı (penceresinden uç uzak) kesin.<ol><li> kılcal iç kaplama kalıcı hasarı önlemek için su ile dolu bir kapaklı evrensel şişenin içine kılcal ucunu bırakın. Bu işlemi kapiler ucu fazla 1 dakika için çevre sıcaklığında maruz her tekrarlayın. </li></ol></li><li> kartuşun çıkış tarafına kılcal giriş ucunu. </li><li> Itin ve kılcal cam kartuş penceresine merkezli dek gerektiği gibi kartuşun içinden kılcal çekin. </li><li> Kartuş penceresine açıklığı tıpasını (100 mm x 200 mm) yerleştirin. NOT: ışık beyaz kaynağına maruz kaldığında beyaz ışık pencereden geçtiğini onaylayın. geçer ışık kahverengimsi bir görünüm varsa, gerektiği gibi ayarlayın. </li><li> (Bu sırayla her iki uçta önceden yüklenmiş boru somun, halkalı ve O-ring ile birlikte), 40.2 cm toplam kapiler uzunluğu önceden oluşturulmuş soğutucu tüp içine kılcal yerleştirin. </li><li> TİKSİNTİ boyunca kılcal itinKılcal boru diğer tarafında görünür kadar gerekli T boru. </li><li> kartuşun çıkış tarafına soğutucu boru ucunu ve boru somunu sıkın. </li><li> kartuşun giriş tarafına kılcal giriş ucunu. </li><li> Itin ve kılcal kartuşun giriş tarafında görünene kadar gerektiği gibi kartuşun içinden kılcal çekin. </li><li> kartuşun giriş tarafına soğutucu boru ucunu ve boru somunu sıkın. </li><li> yarma taş floş kenarını kullanarak tek bir düz harekette kılcal çıkış ucunda (pencerenin en yakın sonu) koruyucu kapağı kesin. </li><li> kılcal uçlarına üzerinde mühür-tutma klipleri yerleştirin ve yerine oturtun için düğmesine basın. Görme kılcal biter kontrol edin. onlar bile değilse, işlemi tekrarlayın. </li><li> tezgah kenarında kılcal uzunluğu şablonu yerleştirin. </li><li> ag aşağı bakacak şekilde yerleştirin kartuşkılcal uzunluğu şablonu ainst ve kılcal şablona referans çizgileri ile biter hizalayın. kılcal ölçüm işaretleri (3.2.4) referans çizgileri aynı hizada değilse, gerektiği gibi ayarlayın. </li><li> kılcal uzunluğu şablonuna karşı kılcal tutun ve şablona referans çizgileri altında yaran taş 2 mm floş kenarını kullanarak kılcal her iki ucunu kesti. </li><li> Görme kılcal büyüteçle biter kontrol edin. kılcal uçları düzgün değilse, yarma taş yumuşak yüzünü kullanarak bunları cilalamak. </li><li> O-ring yerleştirme aracını kullanarak açıklığı tıpası deliğe diyafram O-ring takın. </li><li> şişelere sokulan kılcal uçları hemen kasanın içine kartuş durumda ve yer kartuşu içine su dolu şapkalı evrensel şişeleri takın. Kısa ve uzun süreli depolama için 2-8 ° C&#39;de tutun. </li></ol></li><li> Tampon tepsileri hazırlanması. <ol><li> Dolgu ve şapkalı univers yertampon girişinde el flakon ve çıkış tepsileri (Şekil 1). örneklerin sayısı ile uygun şerit 2, 3, 4 ve 5&#39;te tekrar şişe pozisyonları altı numune enjeksiyon için bir şerit yerleştirme analiz edilecek. NOT: Mevcut sızıntısını önlemek için flakon kapaklar ıslatma kaçının. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55082/55082fig1.jpg" /> Şekil 1: Pozisyon ve tampon giriş ve çıkış tepsileri evrensel şişeleri düzeyini doldurun. seviyeleri doldurun: 1/1 = 1.400 uL, 3/4 = 1300 uL ve 1/2 = 1000 mcL. Kısaltmalar: B = su, HCI = 0.1 M hidroklorik asit. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55082/55082fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> CE sistem bileşenleri montajı. <ol><li> UV detektör takın. </li><li> açılış kollarını yükleyinarayüz bloğu içine basarak. </li><li> Fiber optik kabloyu takın. her iki ucu tutarken, saat yönünde döndürmek kelepçe çubuğuna karşılık gelen ucunu ve. UV dedektör diğer ucunu. NOT: onun kırılmasına neden olabilir bükme beri bu işlem sırasında dikkatli fiber optik kabloyu tutun. </li><li> Yeri örnek ve örnek tutma sistemi içine tampon tepsiler ve pozisyona oturtun. </li><li> iki ucunda kelepçe çubuğunu basarken kolları sıkın, arayüz bloğu içine kılcal kartuşunu yerleştirin ve. </li></ol></li></ol> 4. Enstrüman Yöntemleri Set-up <ol><li> Gerilim, maksimum: Aşağıdaki parametreler ve Tablo 1&#39;den göre, klima oluşturma çalışan ve kapatma enstrüman yöntemleri 30.0 kV; Güncel, max: 300.0 uA; Kartuş sıcaklığı: 20.0 ° C; Numune depolama sıcaklığı: 10.0 ° C; UV detektörü başlangıç ​​şartları: Dalga boyu: 214 nm; Veri hızı: 4 Hz; Filtre: Normal; Tepe genişliği () Işaret eder: 16-25; Absorbans sinyali: Doğrudan. NOT: Veri toplama oranı dar ayırma bölgelerinin kapsamını iyileştirmek amacıyla 25 Hz kadar artırılabilir. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="8"> Klima yöntemi zaman programı </td></tr><tr><td> Süresi (dak) </td><td> Olay </td><td> değer </td><td> süre </td><td> giriş şişe </td><td> çıkış flakon </td><td> özet </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> - </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 dakika </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> ileri </td><td> HCI, 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 dakika </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> ileri </td> &lt;td&gt; Su </td></tr><tr><td> - </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 10.0 dakika </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> ileri </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 0.00 </td><td> Ayrı - Gerilim </td><td> 15.0 KV </td><td> 10.0 dakika </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0.17 Min rampa, normal polarite </td><td> Ayrı </td></tr><tr><td> 10.00 </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2758 mbar </td><td> 10.0 dakika </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> ileri </td><td> BGE </td></tr><tr><td> 20.01 </td><td> Bekleyin </td><td> - </td><td> 0.0 dakika </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> durulayın ipuçları </td></tr><tr><td colspan="8"> yöntem zaman programı çalıştıran </td></tr><tr><td> Süresi (dak) </td><td> Olay </td><td> değer </td><td> süre </td><td> giriş şişe </td><td&gt; Çıkış flakon </td><td> özet </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> - </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 dakika </td><td> BI: C1 </td><td> BO: C1 </td><td> İleri, In / Out şişe inc 6 </td><td> HCI, 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 dakika </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> İleri, In / Out şişe inc 6 </td><td> Su </td></tr><tr><td> - </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 4.0 dakika </td><td> BI: E1 </td><td> BO: C1 </td><td> İleri, In / Out şişe inc 6 </td><td> BGE </td></tr><tr><td> - </td><td> Enjekte - Basınç </td><td> 34 mbar </td><td> 20.0 sn </td><td> SI: A1 </td><td> BO: B1 </td><td> İleri, geçersiz kıl </td><td> örnek Enjeksiyon </td></tr><tr><td> - </td><td> Bekleyin </td><td> - </td><td> 0.4 dakika </td><td> BI: A1 </td><td> BÖA1 </td><td> In / Out flakon inc 6 </td><td> yıkama ipuçları </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Ayrı - Gerilim </td><td> 15.0 KV </td><td> 30.0 dakika </td><td> BI: D1 </td><td> BO: D1 </td><td> 0.17 Min rampa, normal polarite, In / Out şişe inc 6 </td><td> örnek Ayırma </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> otomatik sıfır </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.01 </td><td> verileri Dur </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 30.02 </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 2.0 dakika </td><td> BI: B1 </td><td> BO: C1 </td><td> İleri, In / Out şişe inc 6 </td><td> Su </td></tr><tr><td> 32.03 </td><td> Bekleyin </td><td> - </td><td> 0.0 dakika </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> In / Out flakon inc 6 </td><td> durulayın ipuçları </td></tr><tr><td> 32.04 </td><td> Son </td><td> -</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Son </td></tr><tr><td colspan="8"> Kapatma yöntemi zaman programı </td></tr><tr><td> Süresi (dak) </td><td> Olay </td><td> değer </td><td> süre </td><td> giriş şişe </td><td> çıkış flakon </td><td> özet </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> - </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 1.0 dakika </td><td> BI: E6 </td><td> BO: E6 </td><td> ileri </td><td> HCI, 0.1 M </td></tr><tr><td> - </td><td> Durulama - Basınç </td><td> 2068 mbar </td><td> 6.0 dakika </td><td> BI: F6 </td><td> BO: F6 </td><td> ileri </td><td> Su </td></tr><tr><td> - </td><td> Lamba - Kapalı </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Bekleyin </td><td> - </td><td> 0.0 dakika </td><td> BI: A1 </td><td> BO: A1 </td><td> - </td><td> durulayın ipuçları </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Klima, koşu ve kapatma zamanı programları. 5. Veri Toplama ve İşleme <ol><li> Örnek kümesi programlayın. <ol><li> Klima cihazı yöntemini kullanarak klima için kılcal Program. Kılcal ilk kez kullanıldığında, program, dört tekrarlar; Aksi takdirde şartlandırma yöntemini sadece iki tekrarlar programlayın. </li><li> çalışan alet yöntemi kullanılarak analiz edilecek numune Program. </li><li> kapatma enstrüman yöntemini kullanarak depolama kılcal programlamak ve bölüm 3.2.22 belirtilen işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> deneme çalıştırın. </li><li> elekroferogramlar ihracat. </li><li> göç zamanı ve temel, ana a yüzdesi içeriğini hesaplamakElektroferogram profilinin dikey düşüş çizgisi entegrasyonu kullanarak nd asidik izoformlar. </li></ol>

<ol>
	<li>Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+monoclonal+antibodies+in+the+treatment+of+chronic+autoimmune+diseases.">The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases.</a> Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).</li><li>Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+monoclonal+antibodies.">Heterogeneity of monoclonal antibodies.</a> J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).</li><li>Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+therapeutic+proteins+by+capillary+and+microchip+electrophoresis.">Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis.</a> Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).</li><li>Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic,+Electrophoretic,+and+Mass+Spectrometric+Methods+for+the+Analytical+Characterization+of+Protein+Biopharmaceuticals.">Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals.</a> Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+identity,+charge+variants,+and+disulfide+isomers+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+an+uncoated+capillary+column.">Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column.</a> Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).</li><li>He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+charge+variants+of+monoclonal+antibodies+with+capillary+zone+electrophoresis+in+dynamically+coated+fused-silica+capillary.">Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary.</a> J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).</li><li>Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+capillary+electrophoresis+in+characterizing+recombinant+protein+therapeutics.">Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics.</a> Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).</li><li>&#352;t&#283;p&#225;nov&#225;, S., Ka&#353;i&#269;ka, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+impurities+and+counterions+of+pharmaceuticals+by+capillary+electromigration+methods.">Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods.</a> J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).</li><li>&#352;t&#283;p&#225;nov&#225;, S., Ka&#353;i&#269;ka, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+capillary+electromigration+methods+to+separation+and+analysis+of+proteins.">Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins.</a> Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).</li><li>Espinosa-de la Garza, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+recombinant+monoclonal+antibodies+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis.</a> Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).</li><li>Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intact+protein+analysis+in+the+biopharmaceutical+field.">Intact protein analysis in the biopharmaceutical field.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).</li><li>Altria, K. D., Altria, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting.">Troubleshooting.</a> Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications. , (1996).</li><li>Ma, S., Nashabeh, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+therapeutics+by+capillary+electrophoresis.">Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis.</a> Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).</li><li>Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+for+rapid+identification+of+monoclonal+antibodies+for+routine+application+in+hospital.">Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital.</a> Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).</li></ol>

The authors Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, N&#233;stor O. P&#233;rez, Luis F. Flores-Ortiz and Emilio Medina-Rivero are employees of Probiomed S.A. de C.V., which is developing, manufacturing and marketing biosimilar products. All authors are involved in the development of biosimilar products for Probiomed.

iletken CZE başarılı olasılığını artırmak için mAbs analizleri bu derste, uygun uygulamalarının önemini vurgulamak. CZE rutin olarak kullanılır, ancak, sorunlar kaçınılmaz olarak 12 ortaya çıkar. En iyi sonuç için, onlar aşmak ve zor adımlar gidermek için analisti yardımcı olacak gibi, protokol boyunca dahil edildi notları takip etmek önemlidir. belirli bir koşullar kümesi optimum çözünürlüğü elde etmek üzere büyük bir göz BGE çözeltisi ...

Monoklonal antikorlar (mAbs) nedeniyle pek çok kronik ve dejeneratif hastalıklar 1&#39;e karşı hareket etme kapasitesine artan ilgi ile biyoterapötik proteinlerdir. Diğer biyomoleküllerin gibi, mAb&#39;ler (nihai ürüne biyosentezi dan yani) kendi yaşam döngüsünün tüm aşamalarında çeşitli fizikokimyasal değişiklikler geçmesi yatkındır. Bu modifikasyonlar arasında, ancak bunlarla sınırlı değildir: deamidasyon, glikosilasyon, oksidasyon, siklizasyon, izomerizasyon, agregasyon ve proteolitik bölünme 2. Bu nedenle, içsel izoformları çözmek için yetenekli analitik teknikler kalite spesifikasyonları kurmak için mAb&#39;ler heterojenliği ve istikrarı izlemek için ihtiyaç vardır. Kapiller elektroforez (CE), bir arka plan elektrolit (BGE) ile doldurulmuş dar kaynaşık silika borusu (um aralığında) outinside taşınan yüksek performanslı ayırma teknolojisidir. Bir elektrik alanının uygulanmasıyla, yüklü molekülün (30,000 V kadar)s ters ücret (yani, elektro-odaklı ayırma) ile elektroda doğru göç ederler. CE yüksek gerilim kullanılması klasik jel elektroforezi üstündür hızlı analiz ve verimlilik artışı, izin verir. Kılcal bölge elektroforezi (CZE), rutin olarak, ürün kalitesi değerlendirmesi 3-9 için, ilaç endüstrisinin kullanılan CE bazlı bir tekniktir. CE diğer modları (ör kapiler jel elektroforezi, kapiller izoelektrik odaklama) ya da kromatografisi bazlı yöntemlerden farklı olarak, CZE kendi doğal yapısında 10 yakın mAb&#39;lerin doğasında heterojenite analizini sağlayarak, denatüranlar veya katı faz arayüzleri kullanılmadan yapılabilir . MAb izoformlarının CZE ayrılması bir hidrofilik polimer (nötr kılcal) ile kaplanmış bir kaynaşık silika kılcal içinde oluşur ve yük, kitle, boyut ve şekil (ya da hidrodinamik hacmi) 11 tarafından yönetilir farklı elektroforetik hareketlilik dayanır. mAb parçaları zaman tespit edilirde harekete ve 214 nm&#39;de 4 bir ultraviyole (UV) absorbansı detektörü tarafından algılanan algılama penceresinin geçmesine edilir. Bu analitik tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması öncesi ve deney sırasında detaylara uygun dikkat bağlıdır. sonuçta sürekli başarısızlık ve hayal kırıklığı yol açan, analiz yapmak için maliyet ve zaman artacak, aksi takdirde Oyunculuk. Burada, çözümleri ve örnekler, CE sistemi kurmak enstrüman yöntemleri, veri toplama hazırlanması hazırlanması detaylı açıklamaları ile CZE tarafından mAb heterojenite başarılı bir analizini yapmak için bir adım-adım kılavuz sunmak ve işlem. Bu dokümanın amacı, bir yeniden birleştirici tam olarak insan anti-tümör nekroz faktörü alfa (anti-TNFa) mAb proteini modeli olarak kullanılır; Ancak, bu protokol kolayca kısa değişiklikler göz önüne alınarak diğer proteinlerin analizi için özelleştirilebilir. birdditionally, çeşitli öneriler potansiyel sorunlar önerilmiştir hafifletmek için. okuyucu kesinlikle artacaktır başarılı olasılık olarak, önerilen protokol takip etmek teşvik edilmektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Tecsiquim</td>
			<td>AT0035-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACS grade hydrochloric acid</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Hydroxypropyl) methyl cellulose&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09963</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>517992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2504</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,&#160; pH 8</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>477427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A66528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCAP Neutral capillary&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>477441</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial, Micro, 200 &#181;l</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144709</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Vial Caps</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A62250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Vials</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A62251</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable, Optics, UV/Vis</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144093</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Detector Module</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144733</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Assembly Kit, Blank</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>144738</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

capillary electrophoresis separation of monoclonal antibody isoforms using a neutral capillary

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Şekil 2, bir 200 mM EACA, 30 mM lityum asetat, tipik bir elektrik akımı profilini gösterir, Tris tamponu (50 mM, pH 8.0) ile seyreltildi, anti-TNFa mAb, örnek ile pH 4.8 BGE. Görüldüğü gibi, mevcut analiz boyunca stabil olduğu ve 30 ila 35 uA değerleri arasında salınım yapabilir. Tespit edilen pik histamin iç standart karşılık geldiği Şekil 3 boş numunenin CZE Elektroferogram gösterir. 3.7 4.1 dakikalık bir göç vakit geçirmek h...

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Nötr Kılcal kullanılarak monoklonal antikor izoformlannın Kapiler Elektroforez Ayırma

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

capillary-electrophoresis-separation-monoclonal-antibody-isoforms

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.6K Görüntüleme.  Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.. Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Video: Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Biyokimya

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Highly Sensitive and Quantitative Detection of Proteins and Their Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing Method

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides an alternative strategy, capillary isoelectric focusing (cIEF), with many advantages compared to conventional immunoblotting. This is an antibody-based, automated, rapid, and quantitative method in which a complete western blotting procedure takes place inside an ultrathin capillary. This technique does not require a gel to transfer to a membrane, stripping of blots, or x-ray films, which are typically required for conventional immunoblotting. Here, proteins are separated according to their charge (isoelectric point; pI), using less than a microliter (400 nL) of total protein lysate. After electrophoresis, proteins are immobilized onto the capillary walls by ultraviolet light treatment, followed by primary and secondary (horseradish peroxidase (HRP) conjugated) antibody incubation, whose binding is detected through enhanced chemiluminescence (ECL), generating a light signal that can be captured and recorded by a charge-coupled device (CCD) camera. The digital image can be analyzed and quantified (peak area) using software. This high throughput procedure can handle 96 samples at a time; is highly sensitive, with protein detection in the picogram range; and produces highly reproducible results because of automation. All of these aspects are extremely valuable when the quantity of samples (e.g., tissue samples and biopsies) is a limiting factor. The technique has wider applications as well, including screening of drugs or antibodies, biomarker discovery, and diagnostic purposes.

Capillary isoelectric focusing is an antibody-based, ultrasensitive, high throughput technique, enabling detailed characterization of proteins and their isoforms from extremely small biological samples. The following describes a protocol for detection and quantification of specific proteins and their isoforms in an automated and robotized manner.

Proteinler ve onların izoformlarının kapiller Isoelectric odaklanarak yöntemi tarafından son derece hassas ve nicel tespiti

Immunoblotting has become a routine technique in many laboratories for protein characterization from biological samples. The following protocol provides ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve classes of intrinsically disordered proteins (IDPs) to reduce oxidative and osmotic stress. This article uses a combination of capillary gel electrophoresis (CGE) and mobility shift affinity electrophoresis (ACE) in order to describe the binding behavior of different conformers of the IDP AtHIRD11 from Arabidopsis thaliana. CGE is used to confirm the purity of AtHIRD11 and to exclude fragments, posttranslational modifications, and other impurities as reasons for complex peak patterns. In this part of the experiment, the different sample components are separated by a viscous gel inside a capillary by their different masses and detected with a diode array detector. Afterward, the binding behavior of the sample towards various metal ions is investigated by ACE. In this case, the ligand is added to the buffer solution and the shift in migration time is measured in order to determine whether a binding event has occurred or not. One of the advantages of using the combination of CGE and ACE to determine the binding behavior of an IDP is the possibility to automate the gel electrophoresis and the binding assay. Furthermore, CGE shows a lower limit of detection than the classical gel electrophoresis and ACE is able to determine the manner of binding a ligand in a fast manner. In addition, ACE can also be applied to other charged species than metal ions. However, the use of this method for binding experiments is limited in its ability to determine the number of binding sites. Nevertheless, the combination of CGE and ACE can be adapted for characterizing the binding behavior of any protein sample towards numerous charged ligands.

This protocol combines the characterization of a protein sample by capillary gel electrophoresis and a fast-binding screening for charged ligands by affinity capillary electrophoresis. It is recommended for proteins with a flexible structure, such as intrinsically disordered proteins, to determine any differences in binding for different conformers.

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer structural and functional advantages to mitochondria. SCs have been identified in many species, from yeast to mammal, and an increasing number of studies report disruption of their organization in genetic and acquired human diseases. As a result, an increasing number of laboratories are interested in analyzing SCs, which can be methodologically challenging. This article presents an optimized protocol that combines the advantages of Blue- and Clear-Native PAGE methods to resolve and analyze SCs in a time-effective manner. With this hybrid CN/BN-PAGE method, mitochondrial SCs extracted with optimal amounts of the mild detergent digitonin are exposed briefly to the anionic dye Coomassie Blue (CB) at the beginning of the electrophoresis, without exposure to other detergents. This short exposure to CB allows to separate and resolve SCs as effectively as with traditional BN-PAGE methods, while avoiding the negative impact of high CB levels on in-gel activity assays, and labile protein-protein interactions within SCs. With this protocol it is thus possible to combine precise and rapid in gel activity measurements with analytical techniques involving 2D electrophoresis, immuno-detection, and/or proteomics for advanced analysis of SCs.

Here we present a protocol to extract, resolve and identify mitochondrial supercomplexes which minimizes exposure to detergents and Coomassie Blue. This protocol offers an optimal balance between resolution, and preservation of enzyme activities, while minimizing the risk of losing labile protein-protein interactions.

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, DNA is visualized by staining. This article demonstrates how to use thiazole orange to stain DNA. Thiazole orange compares favorably to common staining methods, in that it is sensitive, inexpensive, excitable with UV or blue light (to prevent sample damage), and safer than ethidium bromide. Labs already equipped to run DNA electrophoresis experiments using ethidium bromide can generally switch dyes with no additional changes to existing protocols, using UV light for detection. Blue-light detection to avoid sample damage can additionally be achieved with a blue-light source and emission filter. Labs already equipped for blue-light detection can simply switch dyes with no additional changes to existing protocols.

Here, we present a protocol to use thiazole orange for the detection of DNA in gel electrophoresis experiments. The use of thiazole orange allows elimination of ethidium bromide, and fluorescence detection can be achieved with either UV or blue light.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins of several nucleotide-derived secondary messengers (NSMs) have been systematically identified and studied in model organisms. These achievements are mainly due to the development of several new techniques including the capture compound technique and the differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA), which were used to systematically identify target proteins of these small molecules. This paper describes the use of the NSMs, guanosine penta- and tetraphosphates (p)ppGpp, as an example and video demonstration of the DRaCALA technique. Using DRaCALA, 9 out of 20 known and 12 new target proteins of (p)ppGpp were identified in the model organism, Escherichia coli K-12, demonstrating the power of this assay. In principle, DRaCALA could be used for studying small ligands that can be labeled by radioactive isotopes or fluorescent dyes. The critical steps, pros, and cons of DRaCALA are discussed here for further application of this technique.

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

The Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) can be used to identify small ligand binding proteins of an organism by using an ORFeome library.

Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...