Size açıklanan MEA 4-AP spinal dilim preparatı, dorsal boynuz devrelerinin bağlantısını ve bu ağların spinal duyusal işlem sırasında nasıl etkileşime girdiğini incelemek için bir platform sağlar. Sunulan metodoloji, dorsal boynuz devresi aktivitesinin makroskopik bölgesel çözünürlük düzeyinde araştırılmasını sağlar. Bu preparat, bileşiklerin spinal duyusal devrelerde sinyalleşmeyi bozma yeteneğini değerlendirmek için hızlı bir tarama aracı olarak kullanılabilir.
Bu yöntem, belirli hücre tiplerinin ve küçük mikro devrelerin aktivitesinin, dorsal boynuz davranış tepkilerinin çıktısını ve nihayetinde ağrı deneyimini şekillendirmek için büyük nöron popülasyonlarını nasıl etkilediğine dair anlayışımızdaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur. Başlamak için, MEA'yı 30 dakika boyunca at serumu ile iyice doldurun. Serumu çıkardıktan sonra, damıtılmış su köpüksüz hale gelene kadar MEA'yı damıtılmış suyla beş kez iyice durulayın.
Ardından, kuyuyu yapay BOS ile doldurun. Anestezi uygulanan farenin kafasını kestikten sonra, kalça seviyesinde deride küçük bir kesi yaparak karın bölgesi üzerindeki cildi çıkarın. Daha sonra, tüm cilt göğüs kafesinin üstünden pelvisin tepesine hem ventralal hem de dorsal olarak çıkarılana kadar kesimin her iki tarafındaki cildi rostral olarak çekin.
Vücudu buzun üzerine yerleştirdikten sonra, visserayı çıkararak ve kaburgaları yanal olarak sternuma keserek vertebral kolonu açığa çıkarmak için ventral bir yaklaşım kullanın. Ventral göğüs kafesini, hem kürek kemiğini hem de alt ekstremiteleri ve pelvisi çıkarın. Vertebral kolon ve kaburga preparatını, buz gibi soğuk sakkaroz yapay BOS içeren bir diseksiyon banyosuna aktarın.
Pimleri alt sırt kaslarından ve bağlı üst kaburgalardan geçirerek preparatın dört köşesini de sabitleyin. Omurların ventral yüzeyini kaplayan tüm kas ve bağ dokusunu rongeurlarla çıkarın ve yaklaşık olarak T12-L2 vertebral gövdelerinin altında yatan lumbo-sakral genişleme üzerindeki vertebral bölgeyi tanımlayın. Vertebral kanalda oturan omuriliğe erişmek için lumbo-sakral genişleme bölgesine bir vertebral vücut kaudalini çıkarın.
Kavisli yay makası kullanarak, omurların ventral ve dorsal yönlerini ayırmak ve omuriliği açığa çıkarmak için vertebral gövdeyi rostral olarak kaldırırken ve çekerken vertebral pedikülleri iki taraflı olarak kesin. Lumbo-sakral genişlemeyi ortaya çıkarmak için vertebral cisimler çıkarıldıktan sonra, kordon serbest yüzene kadar omuriliği yaylı makasla sabitleyen kalan kökleri dikkatlice temizleyin. Kordonun hedef bölgesini serbest yüzer hale getirmek için omuriliği lumbo-sakral genişlemenin üstünde ve altında rostral ve kaudal kesiklerle izole edin.
Enine dilimler için, lumbo-sakral segmenti, merkezinde sığ bir kanal kesimi olan önceden kesilmiş bir polistiren blok üzerine bağlı bir rota ile kaldırın ve yerleştirin. Daha sonra, bloğu ve kordonu kesit platformuna bağlamak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın ve buz gibi soğuk sakkaroz yapay BOS bulamacı içeren kesme banyosuna yerleştirin. 300 mikrometre kalınlığındaki dilimler elde edildikten sonra, dilimleri oksijenli yapay BOS içeren bir hava arayüzü inkübasyon odasına aktarın ve dilimlerin oda sıcaklığında bir saat boyunca dengelenmesine izin verin.
Dorsal boynuz aktivitesini kaydetmeye başlamak için, yapay BOS ile doldurulmuş büyük uçlu bir pastör pipeti kullanarak dilimi inkübatörden MEA kuyusuna aktarın ve ek yapay BOS ekleyin. Dilimi 60 elektrot kayıt dizisinin üzerine yerleştirmek için ince bir kısa saç boya fırçası kullanın. Ardından, yerinde tutmak ve MEA elektrotlarıyla iyi teması teşvik etmek için dokunun üzerine ağırlıklı bir boyun yerleştirin.
MEA'yı kayıt merkezi sahnesine yerleştirin. Yüzeysel DH'nin altında mümkün olduğunca çok elektrotun olduğunu doğrulamak için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak dokunun elektrotlar üzerindeki konumunu kontrol edin. En az iki ila altı elektrotun dilimle temas etmediğinden emin olun. Fotoğraf makinesini cihaza bağladıktan sonra, analiz sırasında kullanmak üzere MEA'ya göre dilimin referans görüntüsünü alın.
Ardından, kayıt yazılımında DAQ'yı başlat'a basın ve tüm elektrotların net bir sinyal aldığını onaylayın. Daha sonra, perfüzyon giriş ve çıkış hatlarını yapay BOS ile doldurulmuş MEA'ya takın ve perfüzyon sistemini açın. Akış hızını kontrol edin ve çıkışın süperfüzyonun taşmasını önlemek için yeterli olduğundan emin olun.
Dokuyu beş dakika boyunca dengeledikten sonra, ham temel verileri beş dakika boyunca kaydedin. Perfüzyon giriş hattını yapay BOS'tan 4-aminopiridin çözeltisine taşıyın ve 4-aminopiridin kaynaklı ritmik aktivitenin kararlı duruma ulaşması için 12 dakika bekleyin. Daha sonra, beş dakikalık 4-aminopiridin kaynaklı aktivite kaydedin ve ilaçları test etmek veya 4-aminopiridin stabilitesini kontrol etmek için sonraki kayıtlara hazırlanın.
Her kayıt oturumunu takiben, çizgileri yapay BOS ile durulayın. MEA'yı baş evresinden çıkardıktan ve ağı ve dokuyu MEA'dan iyice çıkardıktan sonra, MEA'yı ve ağı yapay BOS ile durulayın ve tüm işlemi yeni bir dilimle tekrarlayın. Analiz yazılımını açın ve önceden hazırlanmış analiz düzenini yükleyin.
İlgilenilen dosyayı açın ve referans elektrodunun ve aşırı gürültülü olduğu düşünülen elektrotların seçimini kaldırın. Analiz için zaman penceresini ayarlayın. Ardından, kanallar arası filtre sekmesine gidin.
Deney sırasında alınan görüntüye ve notlara göre karmaşık referans ve referans elektrotlarını seçin ve devam etmeden önce Keşfet'e basın. EAP filtresi sekmesine gidin ve LFP etkinliğini kaldırmak için ikinci dereceden yüksek geçişli bir Butterworth filtresi uygulayın. LFP filtresi sekmesine gidin ve EAP etkinliğini kaldırmak için ikinci dereceden bir bant geçişi Butterworth filtresi uygulayın.
EAP algılayıcısı sekmesinde, otomatik eşiği seçtiğinizden emin olun, yükselen ve alçalan kenar kutularını işaretleyin ve ölü süreyi üç milisaniye olarak ayarlayın. Pozitif ve negatif eşikler ayarlamak için, ham veri çözümleyicisi ekranına dönerek, zaman işaretçisini hareket ettirerek, EAP algılayıcısı sekmesine dönerek ve araştır düğmesine basarak verileri inceleyin. Ayarlanan algılama eşiği EAP'leri gürültü veya fizyolojik olmayan etkinlik yakalamadan yakalayana kadar işlemi tekrarlayın.
LFP dedektörü sekmesinde, manuel eşiği seçtiğinizden, yükselen ve alçalan kenar kutularını işaretlediğinizden ve ölü süreyi üç milisaniyeye ayarladığınızdan emin olun. Bir elektrot için eşik değerini ayarlayın ve tatmin olduktan sonra tümüne uygula'yı seçin ve ardından analizi başlat'a basın. Voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti tetrodotoksinin banyo uygulaması, hem EAP hem de LFP aktivitesini ortadan kaldırdı ve bu sinyallerin ani bağımlılığını doğruladı.
4-aminopiridin ile indüklenen aktivite parametrelerinin stabilitesi EAP veya LFP için karakterize edildi. Tüm aktivite özellikleri artı LFP'ler için aktivitenin tesadüfü, 4-aminopiridin uygulamasından 12 dakika sonra ve 15 dakika sonra 4-aminopiridin kaynaklı aktivitenin benzerliğine dayanarak kararlıydı. Özelliğin EAP'leri veya LFP'leri, çoklu elektrotlarda tespit edilen tesadüfi olayların sayısındaki artışla karakterize edildi.
Bağlı bitişik elektrotların sayısı ve 4-aminopiridin stimülasyonunu ve daha sonra göreceli stabiliteyi takiben bitişik elektrotlar ve LFP'ler arasındaki bağlantıların gücü. Dilim oryantasyonu, in vitro preparatlar için önemli bir husustur. 4-aminopiridin stimülasyonu, dilim oryantasyonundan bağımsız olarak SDH'de benzer bir ritmik aktiviteye neden oldu.
Son olarak, DH ağlarının 4-aminopiridin aktivasyonunun önemine daha fazla ışık tutmak için, yüksek bir potasyum yapay BOS çözeltisi banyo uygulandı ve 4-aminopiridin stimülasyonuna benzer bir DH yanıtı uyandırdığı gösterildi. Protokoldeki kilit adımlar, doku hazırlama ve bölümlerin yerleştirilmesinde, dikkatli ancak zamanında diseksiyon yoluyla dokunun sağlıklı olmasını sağlamak ve dokunun MEA üzerinde hassas optimal konumlandırılması, kaliteli sonuçların elde edilmesine yardımcı olacaktır.
