Описанный вам препарат для спинального среза MEA 4-AP обеспечивает платформу для изучения связности цепей дорсального рога и того, как эти сети взаимодействуют во время сенсорной обработки позвоночника. Представленная методология позволяет исследовать активность дорсального рупорного контура на макроскопическом региональном уровне разрешения. Этот препарат может быть использован в качестве инструмента быстрого скрининга для оценки способности соединений нарушать передачу сигналов в спинальных сенсорных цепях.
Этот метод помогает преодолеть разрыв в нашем понимании того, как активность определенных типов клеток и небольших микроцепей влияет на большие популяции нейронов, чтобы впоследствии сформировать выход поведенческих реакций дорсального рога и, в конечном счете, болевой опыт. Для начала наполните MEA хорошо конской сывороткой в течение 30 минут. После удаления сыворотки тщательно промойте MEA пять раз дистиллированной водой, пока дистиллированная вода не станет непенной.
Затем заполните лунку искусственным ликвором. После обезглавливания обезболенной мыши удалите кожу над брюшной областью, сделав небольшой разрез на коже на уровне бедер. Затем потяните кожу по обе стороны от разреза рострально, пока вся кожа не будет удалена из верхней части грудной клетки в верхнюю часть таза, как вентрально, так и дорсально.
После размещения тела на льду используйте вентральный подход, чтобы обнажить позвоночный столб, удалив внутренние органы и разрезав ребра сбоку к грудине. Удалите вентральную грудную клетку, обе лопатки, а также нижние конечности и таз. Переведите подготовку позвоночного столба и ребра в рассекающую ванну, содержащую искусственный ликвор ледяной сахарозы.
Зафиксируйте все четыре угла препарата, поместив булавки через мышцы нижней части спины и прикрепленные верхние ребра. Удалите всю мышечную и соединительную ткань, покрывающую вентральную поверхность позвонков с ронгерами, и определите позвоночную область над пояснично-крестцовым увеличением, которое лежит примерно под телами позвонков T12-L2. Удалите хвостовое тело позвонка в пояснично-крестцовую область увеличения, чтобы получить доступ к спинному мозгу, сидящему на позвоночном канале.
Используя изогнутые пружинные ножницы, прорежьте позвоночные ножки двусторонне, поднимая и вытягивая тело позвонка рострально, чтобы разделить вентральный и дорсальный аспекты позвонков и обнажить спинной мозг. После того, как тела позвонков удалены, чтобы выявить пояснично-крестцовое увеличение, тщательно очистите оставшиеся корешки, которые закрепляют спинной мозг пружинными ножницами, пока спинной мозг не выйдет на свободу. Изолируйте спинной мозг с ростральными и каудальными разрезами выше и ниже пояснично-крестцового расширения, чтобы целевая область пуповины плавала свободно.
Для поперечных срезов поднимите и поместите пояснично-крестцовый сегмент прикрепленным путем на предварительно нарезанный полистирольный блок с неглубоким каналом, вырезанным в центре. Затем используйте цианоакрилатный клей, чтобы прикрепить блок и шнур к секционной платформе и поместить его в режущую ванну, содержащую ледяную сахарозу, искусственную суспензию ликвора. После получения срезов толщиной 300 микрометров перенесите срезы в инкубационную камеру с воздушным интерфейсом, содержащую оксигенированный искусственный ликвор, и дайте срезам уравновеситься в течение одного часа при комнатной температуре.
Чтобы начать запись активности дорсального рога, перенесите срез из инкубатора в колодец MEA с помощью пипетки с большим кончиком пастера, заполненной искусственным ликвором, и добавьте дополнительный искусственный ликвор. Используйте тонкую короткую кисть для волос, чтобы расположить срез над 60 электродами записывающего массива. Затем поместите утяжеленную шею на ткань, чтобы удерживать ее на месте и способствовать хорошему контакту с электродами MEA.
Поместите MEA в стадию записывающей головки. Проверьте положение ткани над электродами с помощью инвертированного микроскопа, чтобы подтвердить, что под поверхностным DH находится как можно больше электродов. Убедитесь, что по крайней мере два-шесть электродов не контактируют с срезом. После подключения камеры к устройству сделайте эталонное изображение среза относительно MEA для использования во время анализа.
Затем нажмите запустить DAQ в программном обеспечении записи и убедитесь, что все электроды получают четкий сигнал. Затем присоедините впускную и выходную линии перфузии к MEA, хорошо заполненному искусственным ликвором, и включите перфузионную систему. Проверьте скорость потока и убедитесь, что отток достаточен для предотвращения переполнения суперфузата.
После уравновешивания ткани в течение пяти минут запишите исходные данные в течение пяти минут. Переместите впускную линию перфузии из искусственного ликвора в раствор 4-аминопиридина и подождите 12 минут, пока ритмическая активность, индуцированная 4-аминопиридином, достигнет устойчивого состояния. Затем запишите пять минут активности, индуцированной 4-аминопиридином, и будьте готовы к последующим записям, чтобы протестировать препараты или проверить стабильность 4-аминопиридина.
После каждого сеанса записи промывайте линии искусственным ликвором. После удаления МЭА со стадии головки и удаления сетки и ткани из колодца МЭА промыть МЭА и сетку искусственным ликвором и повторить весь процесс с новым срезом. Откройте программное обеспечение для анализа и загрузите готовый макет анализа.
Откройте интересующий файл и снимите флажок эталонного электрода и любых электродов, которые считаются чрезмерно шумными. Установите временное окно для анализа. Затем перейдите на вкладку Межканальный фильтр.
Выберите сложные опорные и опорные электроды на основе сделанного изображения и заметок, сделанных во время эксперимента, и нажмите Explore, прежде чем продолжить. Перейдите на вкладку Фильтр EAP и примените фильтр Баттерворта второго порядка, чтобы удалить активность LFP. Перейдите на вкладку Фильтр LFP и примените фильтр Баттерворта второго порядка, чтобы удалить активность EAP.
На вкладке Детектор EAP убедитесь, что выбран автоматический порог, отмечены верхние и опускающиеся края и установлено мертвое время на три миллисекунды. Чтобы установить положительные и отрицательные пороговые значения, проверьте данные, вернувшись на экран анализатора необработанных данных, переместив маркер времени, вернувшись на вкладку детектора EAP и нажав кнопку «Исследовать». Повторяйте процесс до тех пор, пока установленный порог обнаружения не захватит EAP без захвата шума или нефизиологической активности.
На вкладке детекторА LFP убедитесь, что выбран порог вручную, отмечены верхние и опускающиеся края и установлено мертвое время на три миллисекунды. Установите пороговое значение для одного электрода и, как только будете удовлетворены, выберите Применить ко всем, а затем нажмите начать анализ. Применение в ванне антагониста натриевого канала напряжения тетродотоксина отменило активность как EAP, так и LFP, подтверждая пиковую зависимость этих сигналов.
Стабильность параметров активности, индуцированных 4-аминопиридином, была охарактеризована для EAP или LFP. Все характеристики активности плюс совпадение активности для LFP были стабильными на основе сходства активности, индуцированной 4-аминопиридином, через 12 минут после применения 4-аминопиридина и через 15 минут. EAP или LFP функции характеризовались увеличением числа совпадающих событий, обнаруженных на нескольких электродах.
Количество связанных соседних электродов и прочность связей между соседними электродами и LFP после стимуляции 4-аминопиридином и последующей относительной стабильности. Ориентация среза является важным фактором для препаратов in vitro. Стимуляция 4-аминопиридином индуцировала аналогичную ритмическую активность в SDH независимо от ориентации среза.
Наконец, чтобы пролить дополнительный свет на актуальность активации 4-аминопиридина в сетях DH, был применен повышенный раствор искусственного ликвора калия, который, как было показано, вызывает аналогичный ответ DH на стимуляцию 4-аминопиридином. Ключевыми шагами в протоколе являются подготовка тканей и размещение срезов, обеспечение здоровья ткани путем тщательного, но своевременного рассечения, а также деликатное оптимальное позиционирование ткани на MEA поможет в получении качественных результатов.
