La préparation de tranches vertébrales MEA 4-AP qui vous est décrite fournit une plate-forme pour étudier la connectivité des circuits de la corne dorsale et la façon dont ces réseaux interagissent pendant le traitement sensoriel de la colonne vertébrale. La méthodologie présentée permet d’étudier l’activité du circuit de la corne dorsale à un niveau de résolution régional macroscopique. Cette préparation peut être utilisée comme outil de dépistage rapide pour évaluer la capacité des composés à perturber la signalisation dans les circuits sensoriels de la colonne vertébrale.
Cette méthode aide à combler le fossé dans notre compréhension de la façon dont l’activité de types cellulaires spécifiques et de petits micro-circuits influence de grandes populations de neurones pour façonner par la suite la sortie des réponses comportementales de la corne dorsale et, en fin de compte, l’expérience de la douleur. Pour commencer, remplissez bien le MEA avec du sérum pour chevaux pendant 30 minutes. Après avoir retiré le sérum, rincez soigneusement le MEA cinq fois avec de l’eau distillée jusqu’à ce que l’eau distillée devienne non mousseuse.
Ensuite, remplissez le puits avec du LCR artificiel. Après avoir décapité la souris anesthésiée, retirez la peau sur la région abdominale en faisant une petite coupure dans la peau au niveau des hanches. Ensuite, tirez la peau de chaque côté de la coupe de manière rostrale jusqu’à ce que toute la peau soit retirée du haut de la cage thoracique vers le haut du bassin, à la fois ventralement et dorsalement.
Après avoir placé le corps sur la glace, utilisez une approche ventrale pour exposer la colonne vertébrale en retirant les viscères et en coupant les côtes latéralement jusqu’au sternum. Retirez la cage thoracique ventrale, les deux omoplates, ainsi que les membres inférieurs et le bassin. Transférer la colonne vertébrale et la préparation des côtes dans un bain de dissection contenant du lcrès artificiel de saccharose glacé.
Épinglez les quatre coins de la préparation en plaçant des épingles à travers les muscles du bas du dos et les côtes supérieures attachées. Enlevez tous les muscles et le tissu conjonctif recouvrant la surface ventrale des vertèbres avec les rongeurs et identifiez la région vertébrale au-dessus de l’élargissement lombo-sacré, qui se trouve approximativement sous les corps vertébraux T12-L2. Enlever un corps vertébral caudal à la région d’élargissement lombo-sacré pour accéder à la moelle épinière assise sur le canal vertébral.
À l’aide de ciseaux à ressort incurvés, coupez les pédicules vertébraux bilatéralement tout en soulevant et en tirant le corps vertébral de manière rostrale pour séparer les aspects ventral et dorsal des vertèbres et exposer la moelle épinière. Une fois que les corps vertébraux sont retirés pour révéler l’élargissement lombo-sacré, nettoyez soigneusement les racines restantes qui ancrent la moelle épinière avec des ciseaux à ressort jusqu’à ce que la moelle flotte librement. Isolez la moelle épinière avec des coupures rostrales et caudales au-dessus et au-dessous de l’élargissement lombo-sacré pour que la région cible de la corde ne flotte pas.
Pour les tranches transversales, soulevez et placez le segment lombo-sacré par un itinéraire attaché sur un bloc de polystyrène prédécoupé avec un canal peu profond coupé au centre. Ensuite, utilisez un adhésif cyanoacrylate pour fixer le bloc et le cordon à la plate-forme de sectionnement et placez-le dans le bain de coupe contenant du saccharose glacé artificiel de lcrès. Une fois les tranches de 300 micromètres d’épaisseur obtenues, transférez les tranches dans une chambre d’incubation d’interface d’air contenant du LCR artificiel oxygéné et laissez les tranches s’équilibrer pendant une heure à température ambiante.
Pour commencer à enregistrer l’activité de la corne dorsale, transférez la tranche de l’incubateur au puits MEA à l’aide d’une pipette pasteur à grande pointe remplie de LCR artificiel et ajoutez du LCR artificiel supplémentaire. Utilisez un pinceau à cheveux courts et fins pour positionner la tranche sur le réseau d’enregistrement de 60 électrodes. Ensuite, placez un cou lesté sur le tissu pour le maintenir en place et favoriser un bon contact avec les électrodes MEA.
Placez le MEA dans la tête d’enregistrement. Vérifiez la position du tissu sur les électrodes à l’aide d’un microscope inversé pour confirmer que le plus grand nombre possible d’électrodes se trouvent sous la DH superficielle. Assurez-vous qu’au moins deux à six électrodes n’entrent pas en contact avec la tranche. Après avoir connecté la caméra à l’appareil, prenez une image de référence de la tranche par rapport à l’AEM pour l’utiliser pendant l’analyse.
Ensuite, appuyez sur Démarrer DAQ dans le logiciel d’enregistrement et confirmez que toutes les électrodes reçoivent un signal clair. Ensuite, fixez les conduites d’entrée et de sortie de perfusion au puits MEA rempli de LCR artificiel et allumez le système de perfusion. Vérifiez le débit et assurez-vous que le débit sortant est suffisant pour éviter le débordement du superfusat.
Après avoir équilibré le tissu pendant cinq minutes, enregistrez les données de base brutes pendant cinq minutes. Déplacez la ligne d’entrée de perfusion du LCR artificiel vers une solution de 4-aminopyridine et attendez 12 minutes pour que l’activité rythmique induite par la 4-aminopyridine atteigne l’état d’équilibre. Ensuite, enregistrez cinq minutes d’activité induite par la 4-aminopyridine et préparez-vous aux enregistrements suivants pour tester les médicaments ou vérifier la stabilité de la 4-aminopyridine.
Après chaque séance d’enregistrement, rincez les lignes avec du LCR artificiel. Après avoir retiré le MEA de l’étage de tête et retiré le filet et le tissu du puits MEA, rincez le MEA et le filet avec du LCR artificiel et répétez l’ensemble du processus avec une nouvelle tranche. Ouvrez le logiciel d’analyse et chargez la mise en page d’analyse prédéfinie.
Ouvrez le fichier d’intérêt et désélectionnez l’électrode de référence et toutes les électrodes jugées excessivement bruyantes. Définissez la fenêtre de temps pour l’analyse. Ensuite, accédez à l’onglet Filtre cross-canal.
Sélectionnez les électrodes de référence et de référence complexes en fonction de l’image prise et des notes prises pendant l’expérience et appuyez sur Explorer avant de continuer. Accédez à l’onglet Filtre EAP et appliquez un filtre Butterworth passe-haut de deuxième ordre pour supprimer l’activité LFP. Accédez à l’onglet Filtre LFP et appliquez un filtre Butterworth de deuxième ordre pour supprimer l’activité EAP.
Dans l’onglet Détecteur EAP, assurez-vous de sélectionner le seuil automatique, cochez les cases de bord montant et descendant et réglez le temps mort sur trois millisecondes. Pour définir des seuils positifs et négatifs, inspectez les données en revenant à l’écran de l’analyseur de données brutes, en déplaçant le marqueur temporel, en revenant à l’onglet détecteur EAP et en appuyant sur Explorer. Répétez le processus jusqu’à ce que le seuil de détection défini capture les PAE sans capturer le bruit ou l’activité non physiologique.
Dans l’onglet Détecteur LFP, assurez-vous de sélectionner le seuil manuel, cochez les cases de bord montant et descendant et réglez le temps mort sur trois millisecondes. Définissez le seuil d’une électrode et, une fois satisfait, sélectionnez Appliquer à tous, puis appuyez sur Démarrer l’analyse. L’application en bain de l’antagoniste du canal sodique dépendant de la tension tetrodotoxine a aboli à la fois l’activité EAP et LFP, confirmant la dépendance de pointe de ces signaux.
La stabilité des paramètres d’activité induits par la 4-aminopyridine a été caractérisée pour l’EAP ou la LFP. Toutes les caractéristiques d’activité plus la coïncidence d’activité pour les LFP étaient stables en fonction de la similitude de l’activité induite par la 4-aminopyridine à 12 minutes après l’application de 4-aminopyridine et 15 minutes plus tard. Les PAE ou LFP de la caractéristique ont été caractérisés par une augmentation du nombre d’événements coïncidents détectés sur plusieurs électrodes.
Le nombre d’électrodes adjacentes liées et la force des liaisons entre les électrodes adjacentes et les LFP après la stimulation de la 4-aminopyridine, puis la stabilité relative. L’orientation des tranches est une considération importante pour les préparations in vitro. La stimulation de la 4-aminopyridine a induit une activité rythmique similaire dans la SDH quelle que soit l’orientation de la tranche.
Enfin, pour mieux comprendre la pertinence de l’activation de la 4-aminopyridine des réseaux de DH, une solution de LCR artificielle à haut taux de potassium a été appliquée et il a été démontré qu’elle évoquait une réponse similaire de la DH à la stimulation de la 4-aminopyridine. Les étapes clés du protocole sont la préparation et la mise en place des tissus, en veillant à ce que le tissu soit en bonne santé grâce à une dissection minutieuse, mais opportune, ainsi qu’à un positionnement optimal délicat du tissu sur le MEA aidera à obtenir des résultats de qualité.
