La preparación de rodaja espinal MEA 4-AP que se describe proporciona una plataforma para estudiar la conectividad de los circuitos del asta dorsal y cómo estas redes interactúan durante el procesamiento sensorial espinal. La metodología presentada permite investigar la actividad del circuito del asta dorsal a un nivel macroscópico de resolución regional. Esta preparación se puede utilizar como una herramienta de detección rápida para evaluar la capacidad de los compuestos para interrumpir la señalización en los circuitos sensoriales espinales.
Este método ayuda a cerrar la brecha en nuestra comprensión de cómo la actividad de tipos celulares específicos y pequeños microcircuitos influyen en grandes poblaciones de neuronas para posteriormente dar forma a la salida de las respuestas de comportamiento del asta dorsal y, en última instancia, a la experiencia del dolor. Para empezar, llene bien el MEA con suero de caballo durante 30 minutos. Después de retirar el suero, enjuague bien el MEA cinco veces con agua destilada hasta que el agua destilada no sea espumosa.
Luego, llene el pozo con LCR artificial. Después de decapitar al ratón anestesiado, retire la piel sobre la región abdominal haciendo un pequeño corte en la piel a nivel de las caderas. Luego, tire de la piel a cada lado del corte rostralmente hasta que toda la piel se retire de la parte superior de la caja torácica a la parte superior de la pelvis, tanto ventral como dorsalmente.
Después de colocar el cuerpo sobre hielo, use un enfoque ventral para exponer la columna vertebral eliminando las vísceras y cortando las costillas lateralmente hasta el esternón. Retire la caja torácica ventral, ambas escápulas, y las extremidades inferiores y la pelvis. Transfiera la columna vertebral y la preparación de las costillas a un baño de disección que contenga LCR artificial de sacarosa helada.
Fije las cuatro esquinas de la preparación colocando alfileres a través de los músculos de la espalda baja y las costillas superiores unidas. Elimine todo el músculo y el tejido conectivo que recubre la superficie ventral de las vértebras con los rongeurs e identifique la región vertebral sobre el agrandamiento lumbo-sacro, que se encuentra aproximadamente debajo de los cuerpos vertebrales T12-L2. Retire un cuerpo vertebral caudal a la región de agrandamiento lumbo-sacra para acceder a la médula espinal que se encuentra en el canal vertebral.
Usando tijeras curvas de resorte, corte a través de los pedículos vertebrales bilateralmente mientras levanta y tira del cuerpo vertebral rostralmente para separar los aspectos ventral y dorsal de las vértebras y exponer la médula espinal. Una vez que se extraigan los cuerpos vertebrales para revelar el agrandamiento lumbo-sacro, limpie cuidadosamente las raíces restantes que anclan la médula espinal con tijeras de resorte hasta que la médula flote libre. Aísle la médula espinal con cortes rostrales y caudales por encima y por debajo del agrandamiento lumbo-sacro para hacer que la región objetivo de la médula flote libremente.
Para rodajas transversales, levante y coloque el segmento lumbo-sacro por una ruta adjunta en un bloque de poliestireno precortado con un canal poco profundo cortado en el centro. Luego, use adhesivo de cianoacrilato para unir el bloque y el cordón a la plataforma de seccionamiento y colóquelo en el baño de corte que contenga purín artificial de LCR de sacarosa helada. Una vez que se obtengan las rodajas de 300 micrómetros de grosor, transfiera las rebanadas a una cámara de incubación de interfaz de aire que contenga LCR artificial oxigenado y permita que las rebanadas se equilibren durante una hora a temperatura ambiente.
Para comenzar a registrar la actividad del cuerno dorsal, transfiera la rebanada de la incubadora al pozo MEA utilizando una pipeta pasteur de punta grande llena de LCR artificial y agregue LCR artificial adicional. Use un pincel fino para el cabello corto para colocar la rebanada sobre la matriz de grabación de 60 electrodos. Luego, coloque un cuello pesado sobre el tejido para mantenerlo en su lugar y promover un buen contacto con los electrodos MEA.
Coloque el MEA en el escenario principal de grabación. Verifique la posición del tejido sobre los electrodos usando un microscopio invertido para confirmar que tantos electrodos como sea posible estén debajo del DH superficial. Asegúrese de que al menos dos a seis electrodos no entren en contacto con la rebanada. Después de conectar la cámara al dispositivo, tome una imagen de referencia de la rebanada en relación con el MEA para usarla durante el análisis.
Luego, presione start DAQ en el software de grabación y confirme que todos los electrodos reciben una señal clara. A continuación, conecte las líneas de entrada y salida de perfusión al MEA bien lleno de LCR artificial y encienda el sistema de perfusión. Compruebe el caudal y asegúrese de que el flujo de salida es suficiente para evitar el desbordamiento del superfusado.
Después de equilibrar el tejido durante cinco minutos, registre los datos de referencia sin procesar durante cinco minutos. Mueva la línea de entrada de perfusión del LCR artificial a una solución de 4-aminopiridina y espere 12 minutos para que la actividad rítmica inducida por 4-aminopiridina alcance el estado estacionario. Luego, registre cinco minutos de actividad inducida por 4-aminopiridina y prepárese para las grabaciones posteriores para probar los medicamentos o verificar la estabilidad de la 4-aminopiridina.
Después de cada sesión de grabación, enjuague las líneas con LCR artificial. Después de retirar el MEA de la etapa de la cabeza y eliminar la red y el tejido del pozo MEA, enjuague el MEA y la red con LCR artificial y repita todo el proceso con una nueva rebanada. Abra el software de análisis y cargue el diseño de análisis prefabricado.
Abra el archivo de interés y anule la selección del electrodo de referencia y de los electrodos que se consideren excesivamente ruidosos. Establezca la ventana de tiempo para el análisis. A continuación, vaya a la pestaña filtro de canal cruzado.
Seleccione los electrodos de referencia y referencia complejos en función de la imagen tomada y las notas realizadas durante el experimento y pulse Explorar antes de continuar. Vaya a la pestaña filtro EAP y aplique un filtro Butterworth de paso alto de segundo orden para eliminar la actividad LFP. Vaya a la pestaña filtro LFP y aplique un filtro Butterworth de paso de banda de segundo orden para eliminar la actividad de EAP.
En la pestaña Detector EAP, asegúrese de seleccionar el umbral automático, marque las casillas de borde ascendente y descendente y establezca el tiempo muerto en tres milisegundos. Para establecer umbrales positivos y negativos, inspeccione los datos volviendo a la pantalla del analizador de datos sin procesar, moviendo el marcador de tiempo, volviendo a la pestaña del detector EAP y presionando explorar. Repita el proceso hasta que el umbral de detección establecido capture los EAP sin capturar el ruido o la actividad no fisiológica.
En la pestaña detector LFP, asegúrese de seleccionar el umbral manual, marque las casillas de borde ascendente y descendente y establezca el tiempo muerto en tres milisegundos. Establezca el umbral para un electrodo y, una vez satisfecho, seleccione aplicar a todos y luego presione iniciar análisis. La aplicación en el baño del antagonista del canal de sodio dependiente de voltaje tetrodotoxina abolió la actividad de EAP y LFP, confirmando la dependencia de pico de estas señales.
La estabilidad de los parámetros de actividad inducidos por 4-aminopiridina se caracterizó para EAP o LFP. Todas las características de actividad más la coincidencia de actividad para las LFP fueron estables en función de la similitud de la actividad inducida por 4-aminopiridina a los 12 minutos después de la aplicación de 4-aminopiridina y 15 minutos después. Los EAP o LFP de la función se caracterizaron por un aumento en el número de eventos coincidentes detectados en múltiples electrodos.
El número de electrodos adyacentes unidos y la fuerza de los enlaces entre los electrodos adyacentes y los LFP después de la estimulación con 4-aminopiridina y luego la estabilidad relativa. La orientación de la rebanada es una consideración importante para las preparaciones in vitro. La estimulación con 4-aminopiridina indujo una actividad rítmica similar en la SDH independientemente de la orientación del corte.
Finalmente, para arrojar más luz sobre la relevancia de la activación de 4-aminopiridina de las redes dh, se aplicó un baño de solución de LCR artificial de potasio elevado y se demostró que evoca una respuesta de DH similar a la estimulación de 4-aminopiridina. Los pasos clave en el protocolo son la preparación del tejido y la colocación de secciones, asegurando que el tejido esté sano a través de una disección cuidadosa, pero oportuna, así como un delicado posicionamiento óptimo del tejido en el MEA que ayudará a obtener resultados de calidad.
