Bu protokol kalp ve beyin dokusu dilimleme ve boyama için uygun metodolojiyi gösterir. Ayrıca, görüntü elde etmek için aydınlatma ve kamera kurulumları ve fotoğrafçılık teknikleri oluşturmak için yönergeler sağlar. Bu yöntemler, kemirgen dokularında görüntü planimetrik analizinde ölçümler yapmak için özellikle yararlıdır ve genel bilimsel makro fotoğrafçılık için değerli olabilir.
Başlamak için, kalp kanülünü Krebs-Henseleit çözeltisi ile doldurulmuş şırıngadan ayırın ve% 0.1 metilen mavisi içeren ılık Krebs-Henseleit çözeltisi ile doldurulmuş bir şırıngaya bağlayın. Sıçan kalbini dakikada dört mililitre hızında dört mililitre metilen mavisi çözeltisi ile perfüze edin. Kanülü şırıngadan ayırdıktan ve kalbi kanülden çıkardıktan sonra, kalbi doku kağıdı üzerinde hafifçe yuvarlayarak fazla metilen mavisini çıkarın.
Fazla metilen mavisini çıkardıktan sonra, hemostatik forsepsleri açarak ve cerrahi dikişin etrafındaki plastik boruyu çıkararak koroner arter etrafındaki bağı gevşetin. Daha sonra, lekeli sıçan kalbini dilimleme için paslanmaz çelik bir matrise yerleştirin. Ventrikülleri iki milimetre kalınlığında dilimler halinde kesin ve bir yetişkin sıçan kalbinden altı ila yedi dilim almayı hedefleyin.
Kestikten sonra, dilimleri 15 mililitrelik plastik bir tüpe aktarın. Daha sonra, PBS'de çözünmüş beş mililitre% 1 triphenil tetrazolyum klorürü kalp dilimleri ile tüpe ekleyin ve beş dakika sonra nazik bir karıştırma ile 37 santigrat derecede bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kalp dilimlerini PBS ile en az iki ila üç kez yıkayın ve görüntü yakalamaya hazırlanın.
Beyin sapı da dahil olmak üzere beyni kafatasından çıkardıktan sonra, beyni ventral tarafı yukarı doğru beyin matrisine yerleştirin. Hayvanların ağırlığına bağlı olarak, beyin paslanmaz çelik matrisinin doğru boyutunu seçin. Bıçakları kullanarak, beynin ön ve kaudal kısımlarını kısıtlayın.
Ardından, bıçakları kısmen ilk ve son bıçaklar arasındaki kanallara yerleştirin. Tüm bıçaklar paralel olarak yerleştirildiğinde ve düzenlendiğinde, beyni iki milimetrelik koronal dilimler halinde kesmek için tüm bıçakları avuç içi ile aynı anda bastırın. Ardından, bıçakları iki parmağınızla yanlar boyunca sıkıca tutun ve dilimlenmiş beyinle birlikte matristen çıkarın.
Beyin dilimlerini birer birer bir tepsiye yerleştirin ve her dilimin iç yüzeyinin her zaman yukarı bakmasını sağlayın. Daha sonra, ılık% 1 triphenil tetrazolyum klorür çözeltisi ve PBS'yi beyin dilimlerine dökün ve karanlıkta 37 santigrat derecede sekiz dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, görüntüleri yakalamak için beyin dilimlerini mavi plastik bir tepsiye aktarın.
Beyin dilimlerini frontalden kaudal kısma kadar sıralı sırayla düzenleyin ve sagital düzlemdeki yarımküreleri ayırmak için bir neşter kullanın. Boyama işleminden hemen sonra doku dilimlerini fotoğraflayın. İstediğiniz fotoğraf makinesini şarj edilmiş bir pil, bellek kartı ve standa takılı lensle ayarlayın.
Mevcut ışık kaynaklarına bağlı olarak, uygun beyaz dengesi ayarlarını seçin veya fotoğraf makinesi kılavuzundaki talimatlara göre renk sıcaklığı kalibrasyonu gerçekleştirin. Kalp dilimlerini PBS ile tamamen bir kaba batırın. Beyin dilimlerini PBS veya diğer sıvılar olmadan kuru bir tepsiye yerleştirin.
Makro lensle kameranın altına dilimler içeren kabı yerleştirin. Tüm dilimlerin görüş alanına tam olarak uyduğundan ve aynı düzlemde olduğundan emin olun. Fotoğraf makinesini tamamen manuel moda geçirin, ISO 100'ü ve diyafram açıklığını F10 olarak ayarlayın.
En iyi görüntü pozlaması için deklanşör hızını ayarlayın ve fotoğraf makinesi odak düzleminin numunenin bulunduğu yüzeye paralel olduğundan emin olun. Örnek numarasını yakaladıktan sonra, yansımalar kaybolana kadar dairesel polarize filtreyi döndürün ve deklanşör serbest bırakıldığında kamera sarsıntısını önlemek için uzaktan bir tetikleyici kullanarak doku dilimini görüntüleyin, ardından dilimleri döndürün ve diğer taraftan görüntüler yakalayın. Miyokard enfarktüsünden sonra metilen mavisi ve trifenil tetrazolyum klorür lekeli kalp diliminin bu fotoğrafı, enfarktüs boyutunun daha fazla planimetrik analizi için yeterli ayrıntı ve renk bilgisi içerir.
Kalp dokusunun 24 saat boyunca dondurulması bütünlüğü etkiler ve mitokondriyal fonksiyonu azaltır. Böylece, kalbin triphenil tetrazolium klorür boyaması kırmızı değil, soluk pembedir ve nekrotik ve canlı dokular arasındaki sınır bulanıklaşır. Numunelerdeki yansımaları azaltmak için karşılaştırılan iki yöntemden daldırma en verimli yöntemdir ve iyi kontrasta sahip ayrıntılı görüntüler üretir.
Polarize filtre de etkilidir, ancak görüntünün çözünürlüğünü ve mikro kontrastını biraz azaltır. Daldırma veya filtre olmadan bir kalp diliminin görüntüsü birçok yansıma içerir ve daha fazla analiz için uygun değildir. Planimetrik analizde, beynin etkilenmemiş tarafı inmeden etkilenen taraf ile karşılaştırılmalıdır.
Manuel kamera ayarları, tüm görüntülerin optimum pozlamasını ve beyaz dengesini sağlayarak tek tip analize olanak tanır. Kalp dilimlerinin aşırı pozlanmış ve az pozlanmış görüntülerine örnekler burada gösterilmiştir. Ayrıca, yanlış beyaz dengesi ayarları görüntüde mavi veya sarıya ve macenta veya yeşile kaymasına neden olur.
Bilimsel makro fotoğrafçılık, kontrollü aydınlatma ve uygun bir görüntüleme kurulumu gerektirir. Standartlaştırılmış metodoloji, yüksek kaliteli, ayrıntılı dijital görüntüler sağlar. Bu yöntem tüm deneysel küçük hayvan organı fotoğrafçılığına uygulanabilir.
