Kuyruk kanaması modelleri, deneyler arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için hemostatik bileşiklerin in vivo farmakolojik etkilerini değerlendirmek için önemli araçlar olabilir. Diğer hassas kanama modelleriyle karşılaştırıldığında, modelimiz kan kaybını ve kanama süresini hayatta kalmak yerine son nokta olarak kullanır. Ayrıca, model anestezi altında gerçekleştirilir, böylece hayvanlar için ağrı ve sıkıntı azalır.
Bu teknik, hemofili ve diğer pıhtılaşma bozukluklarının klinik öncesi çalışması için özellikle yararlıdır, çünkü kanın pıhtılaşma ve bir yaralanmadan sonra kanamayı durdurma yeteneğini ölçer. Bu modeli, hemofili A farelerini kullanarak yeni hemofili tedavileri geliştirmek için çalışmalarımızda prokoagülan bileşikleri test ederek yaygın olarak kullandık. Bununla birlikte, diğer hemofilik fare suşları veya hemofilinin bir anti-faktör VIII antikoru ile indüklendiği fareler de kullanılabilir.
Deneyi gösteren, laboratuvarımda uzman teknisyenler olan Sarah ve Dennis olacak. Fareyi anestezi altına aldıktan sonra, bir ısıtma plakasına yerleştirin ve burnun burun konisinde olduğundan emin olun. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için uygun bir göz merhemi uygulayın.
Kuyruk işaret bloğunu kullanarak kuyruğu 2,5 milimetre çapında işaretleyin, kuyruğu yarığa zorlamamaya dikkat edin ve sıkıca oturmasını sağlayın. Daha sonra, intravenöz dozlama için en uygun olan ılık bir kuyruk damarı sağlamak için kuyruğu en az beş dakika boyunca tuzlu su tüpüne yerleştirin. Gerekirse, IV dozlama beş dakika sonra yapılabilir.
Ardından, ısı kaybını azaltmak için farenin üzerine plastik bir kapak yerleştirin. Test çözeltisi dozlamasından sonra kuyrukları beş dakika suya batırın ve ardından kuyruğu kesme bloğuna yerleştirerek ve damarı açığa çıkarmak için 90 derece döndürerek kuyruk damarı transeksiyonunu gerçekleştirin. Test çözeltisinin dozlandığı yerden karşı taraftaki kesimi yapın.
Kanama oluşturmak için 11 numaralı neşter bıçağını kesme bloğunun yarığından çizin, kuyruğu tutun. Ardından, kuyruğu hemen tuzlu suya geri döndürün ve kronometreyi sıfırlayın. Kanama hemen görülebilmelidir.
Kuyruğun tuzlu suya batırılması, tutarlı kanama için önemlidir, çünkü serbest havada hızla durur. Kanamayı gözlemleyin ve kan akışı gösterim kağıdına 40 dakika boyunca kanamanın başlangıcını ve durmasını açıklayın. Birincil kanama, kesim yapıldıktan sonraki üç dakika içinde durmazsa, fareyi diskalifiye edin ve değiştirin, bu da kesimin çok derin olduğunu veya farenin birincil hemostazda eksik olduğunu gösterebilir.
Yaralanmadan 10, 20 ve 30 dakika sonra kanama olmazsa kuyruk kesimine meydan okuyun. Islatılmış ve ılık salin bir gazlı bez kullanarak, kuyruğu salinden çıkarın ve ıslak gazlı bezle kuyruk kesimi üzerinde distal yönde iki kez yumuşak ama sıkıca silin. Her meydan okumadan sonra kuyruğu hemen tuzlu su tüpüne batırın.
Deney bittiğinde, kuyruğu salinden çıkarın, istenirse kan örnekleri toplayın ve hala tam anestezi altındayken fareleri ötenazi yapın. 15 mililitrelik kan toplama tüplerini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 4.000 kez G'de salinle santrifüj edin. Süpernatantı tüplerden atın.
Peleti iki mililitre eritrosit lizing çözeltisinde yeniden askıya alın. Daha sonra, açık bir kahve rengine ulaşana kadar 12 mililitreye kadar lizing çözeltisi ile seyreltin. Toplam hacme dikkat edin ve seyreltmenin iki mililitresini bir hemoglobin tüpüne aktarın.
Hemoglobin analizine kadar soğutun. Rekombinant koagülasyon faktörü VIII tedavi gruplarında optimize edilmiş protokol kullanılarak kan kaybında anlamlı bir azalma gözlendi. Kilogram doz başına 20 uluslararası birim kanamayı tamamen normalleştirdi ve kilogram başına 10 IU, kan kaybını neredeyse vahşi tip aralığının üst sınırına düşürerek önemli bir etkiye neden oldu.
Kanama süresi için de benzer sonuçlar gözlendi. Kilogram grubu başına 5, 10 ve 20 IU'da bir azalma gözlendi ve kilogram başına 20 IU grubunda tamamen normalleştirildi. Vahşi tip farelerde, toplam kan kaybı 200 ila 840 nanomol hemoglobin arasında ve araç farelerinde 5.300 ila 7.100 nanomol hemoglobin arasında değişmiştir.
Ortalama kanama, araçla tedavi edilen farelerde 5.200 nanomol ve kilogram başına 20 IU grubunda 720 nanomol idi. Vahşi tip farelerin kanama süresi bir ila dokuz dakika arasında değişmekte ve kilogram başına 10 ve 20 IU doz seviyeleri kanama süresini bu aralığa düşürmüştür. Kombine verilerde kan kaybı ile kanama süresi arasında güçlü bir korelasyon gözlenmiştir.
Kaydedilen tüm kanama bölümleri, her bir fare için yaşanan kanamaların uzunluğunun ve sayısının görselleştirilmesini sağlamak için çizilmiştir. Araç grubunda, ikinci meydan okumadan sonra, çoğu hayvanın deneyin sonuna kadar kanamaya devam ettiğini unutmayın. Plazma faktör VIII konsantrasyonunun ölçümü, kan kaybını ve kanama süresini azaltmada gözlenen etkinin rekombinant faktör VIII konsantrasyonuna bağlı olduğunu doğruladı.
Trombosit sayıları gözle görülür şekilde etkilenmedi ve hematokrit seviyeleri, orta ve daha yüksek rekombinant faktör VIII dozları alan hayvanlarda normal aralıktaydı, ancak araçta ve kilogram grupları başına bir IU gibi yoğun olarak kanayan hayvanlarda anlamlı derecede düşüktü. Ağır kanama yaşayan hayvanlarda, kan sayımı, özellikle toplam hemoglobin veya hematokrit üzerindeki küçük etkiler ortaya çıkabilir. Bu optimize edilmiş modelde cinsiyetin etkisini değerlendirmek için, hem kan kaybı hem de kanama süresi sonuçları, cinsiyet ve doz faktörleri olarak olmak üzere iki yönlü ANOVA analizine tabi tutulmuştur.
Bu sonuçlar, tedaviye yanıtın cinsiyetler arasında farklılık göstermediğini göstermiştir. Kuyruğun doğru işaretlenmesi ve kesimin oluşturulması, teknikte güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği sağlamak için gerekli adımlardır, kanama yoksa zorluk da öyledir. Ayrıca, iyi anestezi indüksiyonu ve hayvan vücut ısısının korunması özellikle önemlidir.
Bu modeli, kanamayı indükledikten 10 dakika sonra faktör VIIA ile tedavi ederek daha isteğe bağlı bir ortamda yerleşik kanamaların durdurulmasını araştırmak için de kullandık.
