Bugüne kadar pluripotent kök hücrelerden farklılaştırılmış serebral organoidler, yerli insan beyin dokusuna en yakın vitro 3D modeldir. Ek olarak, serebral organoidler çeşitli merkezi sinir sistemi patolojilerini modellemek, farmakolojik olarak aktif maddeleri test etmek ve ayrıca rejeneratif tıpta kullanılmak üzere eşit derecede uygundur. Bu arada, bu teknoloji hala gelişimin ilk aşamasındadır.
Protokol, agrega elde etme yöntemine ve farklılaşma ile daha fazla ekime bağlı olarak iki gruba ayrılabilir. Birincisi, ekim süresinde farklı olan protokol ve farklılaşma şemalarını ve piyasa tüpleri veya plakaları gibi özel düşük yapışma cihazlarında çalkalayıcıda organoidin daha sonra olgunlaşmasıyla farklılaşma indükleyicilerini içerir. Başka bir grup özel bir biyoreaktör kullanmayı içerir.
Çeşitli protokollerin analizi, organoidlerin dolaşımdaki besin ortamı ile koşullar altında yetiştirilmesi gerektiğini göstermiştir. Bununla birlikte, standart bir boyuta ve morfolojiye sahip organoid elde etmek için basit ve ucuz sistemlerin bulunmaması, işlemi ölçeklendirme için bu tür cihazların geliştirilmesini gerektirir. Bu çalışmada, büyük miktarlarda yüksek kaliteli organoid elde etmeyi mümkün kılan basit ve ucuz mini biyoreaktörleri elde etme ve test etme yöntemimizi açıklıyoruz.
Steril 15 mililitre santrifüj tüplerini 7 veya 8 milimetre yüksekliğinde halkalara kesin. Halkaları otoklavla. Tedavi edilen veya mikrobiyolojik Petri kaplarındaki düşük toplamaları kırıntılara ayırın.
Sıvı bir plastik hazırlamak için yaklaşık 1 gram plastik kırıntıyı bir gecede 10 mililitre kloroformda çözün. Steril ultra düşük yapışma 6 santimetre Petri kabının ortasına plastik bir düğme yapın. Eşit derecede uygun iki yol vardır.
birincisi, otoklavı bir merkeze plastik bir halkaya koyun ve halkanın içine yarım mililitre sıvı plastik uygulayın. İkincisi, herhangi bir plastik halka olmadan Petri kabının ortasına yarım mililitre sıvı plastik bırakın. Bulaşıkları laminer akış davlumbazında tam kuruluk olana kadar 2 veya 3 saat açık bırakın.
Pluripotent kök hücreler için ortamda indüklenmiş pluripotent kök hücreler, 35 milimetre Petri kaplarında% 75 veya% 90'a kadar izdiham, soğuk Dulbecco Modifiye Kartal Ortası'nda çözünmüş bir matris ve Fisher-12 ortamı ile önceden kaplanmış. Orta A artı serum replasmanı hazırlayın. Serum replasmanı ile indüklenmiş pluripotent kök hücreleri ortamda 1 gün boyunca yetiştirin.
Pluripotent kök hücreler için ortamı, farklılaşmanın sıfır gününde serum replasman ortamına değiştirin. Orta A'yı hazırlayın.Farklılaşmanın 2. Hücreleri 2 hafta boyunca orta A'da yetiştirin, Petri yemeklerinde her 2 günde bir ferahlatıcı ortam.
14. günde, her kuyuda yaklaşık 1.200 mikrowell içeren özel bir 24 kuyu kültür plakası kullanarak küresel oluşumuna başlayın. Mikrowells ile 24 kuyulu bir kültür plakası hazırlayın. Her kuyuya 1 mililitre orta A ekleyin, plaka tutucu ile donatılmış bir sallanan kova rotorunda 5 dakika boyunca 1, 300g'de kısa bir süre santrifüj ekleyin.
Mikroskop altında mikrowelllerde kabarcık olmadığını kontrol edin. Orta B'yi hazırlayın.Ortamı Petri kabından çıkarın. Hücre müfrezesi için, PBS'de hazırlanan 1,5 mililitre EDTA çözeltisi ile hücreleri tedavi edin.
Mikroskop altında hücre müfrezesini kontrol edin. Hücreyi 15 mililitrelik tüpe topla. Tüpe hücrelere doğru 5 mililitre karışık Dulbecco ve Fisher ortamı ekleyin.
5 dakika boyunca 200g'de santrifüj. Süpernatant çıkarın ve 2 mililitre orta B hücreli hücreleri yeniden askıya alın.1 milyar hücre içeren hücre süspansiyonu mikrowells ile 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın. Birkaç kez aşağı yukarı yavaşça pipet hücreleri ve mikroüllerde hücre yakalamak için 1 dakika boyunca kısaca 100g santrifüj.
Mikroskop altında hücrenin mikroüllerde eşit olarak dağıtıldığını kontrol edin. Sferoidlerde hücre toplama için plakayı bir gecede kuluçkaya yatırın. Ertesi sabah, 15.
Küreselleri her kuyudan 15 mililitrelik bir tüpe dikkatlice toplayın, küreselleri yerçekimi ile 2 ve 3 dakika çökeltmeye bırakın ve ardından süpernatantı çıkarın. Sferoidlere matrisin 2 mililitresini ekleyin, buz üzerinde çözünür ve eski tempore. Pipetleme ile hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Matrisin fazlalığını yıkamak için, tüpe 8 mililitre orta B.Pipet ekleyin, ardından tüpü 100g'da 1 dakika santrifüjleyin. Üsttekini çıkarın. Tüpe 20 mililitre orta B ekleyin, pipet hafifçe, sonra küresel süspansiyonu mini biyoreaktörler arasında bölün.
Daha sonra mini biyoreaktörleri suyun buharlaşmasını ve kirlenmeyi önleyen 15 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Petri kabını mini biyoreaktörlerle yörüngesel bir çalkalayıcıya koyun. Organoidleri 70, 75rpm dönme hızında yetiştirin.
16. günde, orta C.Transfer organoidi 50 mililitre tüpe hazırlayın. 5 dakika boyunca, dibe düşmelerine izin verin. Süpernatantı aspire edin ve 5 mililitre orta C ekleyin.Mini biyoreaktörlerdeki organoidlere tekrar katıl.
Sferoidleri 2 hafta boyunca orta C'de yetiştirin ve ortamı her 2 günde bir yenileyin. Bu 2 hafta boyunca, aşağıdaki ekim için mini biyoreaktör başına yaklaşık 100 küresel seçin. 30. günde, orta D.Ekimi bir olgunlaşma ortamı olan orta D'ye değiştirin.
3 hafta boyunca her 2 veya 3 günde bir ekim ortamını yenileyin. Daha sonra F ve GDNF'de çözünmüş orta D'yi kullanın. Orta A ve B'de 1 ay ardışık ekimden sonra, boyut ve morfolojide standartlaştırılmış organoidler elde edilir.
Büyüdükçe, ortamı daha sık değiştirmeleri gerekir, haftada 4 defaya kadar da artar. 2 aylık ekimden sonra çapları 4 ve 5 milimetreye ulaşır. Ve bir ay sonra, 5 ve 6 milimetre ve büyüme durur.
Şekil organoid enzimin görünümünü, hematoksilin ve eozin ile boyanmış net bölümleri göstermektedir. 1 ay boyunca yapılan immünohistokimyasal analiz, merkezi kısım dahil olmak üzere SOX2 pozitif progenitör hücre kümelerinin varlığını göstermektedir. Organoidlerin periferinde glial fibriliner asidik protein, mikrotübül ilişkili protein 2 ve tiyazine hidrolaz pozitiftir.
Hücreler konsantre edilir, bu da olgun nöron formuna karşılık gelir. Bazı durumlarda, orta kısımda nekrotik alan üzerinde beyaz kümeler oluşur. Bu, daha büyük organoidler elde etmek için bu protokolün sınırlandırılmasını gösterir.
Büyük olasılıkla, büyümenin sınırlayıcı faktörü besin ve oksijenin difüzyon oranıdır. Çeşitli ortam ve hücre tipi sferoidler ve sistemimizi bazı organoid türleri için test etmek. Çok sayıda beyin ve retina, karaciğer karsinom hücrelerinden ve mezenkimal kök hücrelerden kombine organoidler, capital blast mezenkimal kök çağrılarından kombine organoidler ve hematopoetik kök hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden ve bağırsak organoidlerinden farklılaşması.
Hücrelerin ilk bileşiminde değişken miydi? Farklılaşma faktörleri, kültür ve orta, hücre dışı matris ve muhtemelen gaz karışımı bileşimi, platform dönüş hızı ve diğer parametreler. Çeşitli organ ve dokularda aynı şekil, boyut veya morfoloji modeline sahip organoid elde etmek mümkün olacaktır.
Bu çalışmada önerilen mini biyoreaktörlerin kullanımı.
