Bu protokol, nöral kök hücre aktivasyon durumunu bir dizi teknik avantajla sınıflandırmak için yeni bir yaklaşım sağlar. Bu protokolü kullanarak, nöral kök hücre aktivasyon durumunun canlı hücre etiketi içermeyen tek hücre çözünürlük analizini elde edebiliriz. Bu protokol, erişkin nörogenezini düzenleyen mekanizmalara ışık tutmak için kullanılabilir.
Otofloresan, araştırmacıların çalışmaya alışkın olduğu birçok florofordan çok daha sönüktür. Verilerinizi toplamak için daha yüksek lazer güçleri kullanma konusunda kendinize güvenin. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan eski bir yüksek lisans öğrencisi olan Chris Morrow olacak.
Otofloresan görüntüleme için konfokal mikroskobu yapılandırarak başlayın. 405 Lazer'e tıklayın ve 405 lazer menüsünün altındaki emisyon penceresine yazın. İletilen bir ışık görüntüsünü toplamak için TD'ye tıklamaya devam edin ve örneği görselleştirmek için HV değerini ayarlayın.
Lazer gücünü %3.5'e ayarlayın ve kazancı 75'e ayarlayın. Yakınlaştırmayı ikiye ayarlayın. Konfokal tarama parametreleri için piksel duraklamasını 0,5 ve çözünürlüğü 2048 x 2048 piksel olarak ayarlayın.
Parlak alan altında 60X yağa daldırma objektif lensi kullanarak hücreleri odak noktasına getirin. Konfokal tarama moduna geçmek için Göz Bağlantı Noktası'na tıklayın. Işık yolunun tarama kafasına doğru yönlendirildiğinden emin olun ve ışık yolunu engelleyen bir filtre küpü olmadığından emin olun.
Tara'ya tıklayın, ardından görüntüye odaklanın ve hareketsiz nöral kök hücrelerde ve aktif nöral kök hücrelerde otofloresan görüntülerini elde etmek için Yakala'ya tıklayın. Her hücrenin temsili bir kesiti için odakta hücrelerin sitoplazması ile tek düzlem görüntüleri topladığınızdan emin olun. Düşük lazer güçleriyle görüntülemeye başlayın ve doygunluğa neden olmadan otofloresan sinyali algılanabilir hale gelene kadar gücü kademeli olarak artırın.
Hareketsiz nöral kök hücreleri ve aktif nöral kök hücreleri 130 mikrometrelik bir nozul kullanarak bir akış sitometresi ile analiz edin. Cihazın yeteneklerine göre optik koşulları uygulayın ve noktasal otofloresansı tespit edin. Bir veri dosyasında en az 10.000 singlet qNSC ve aNSC toplayın.
Bu verileri, qNSC'lerden veya aNSC'lerden oluşan zenginleştirilmiş bir popülasyonu toplamak için kapılar tasarlamak için kullanın. Daha sonra singlet hücreleri, aNSC ortamı ile doldurulmuş PLO laminin kaplı oyuklara sıralayın. FACS'tan sonra, nöral kök hücrelerin üç saat boyunca kuluçkaya yatmasına izin verin.
Hücreleri sabitlemek için% 4 paraformaldehit ekleyin, yemeğin altını kaplamak ve inkübe etmek için yeterli olduğundan emin olun. 15 dakika sonra, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS'de% 0.25 Triton ile geçirgen hale getirin. Bunu takiben, hücrelere oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir EdU boyama solüsyonu uygulayın.
Ardından, numuneleri PBS ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Uygun bir görüş alanı bulmak için oküler kullanarak başlayın ve çoklu foton ile karanlıkta görüntülemeyi sağlamak için mikroskoptaki örneğe giden ışık yolunu ayarlayın. Birinci kanal görüntüsünün toplanması için ayarlayın.
Güç kazancı sekmesine gidin ve PMT'deki kazancı 800 olarak ayarlayın. 2P Lazer sekmesine tıklayın ve lazer dalga boyu için 750 nanometre seçin ve doğru filtre küpünün kullanıldığından emin olun. Birinci kanal görüntüsünü toplamak için Güç Kazancı sekmesine tıklayın ve Pockel'leri 30 olarak ayarlayın.
Ardından ekranın tarama bölümüne ilerleyin ve önizleme modunu başlatmak için Canlı Tarama'ya tıklayın. Düşük lazer gücünde uygun bir görüş alanı elde etmek için Pockel'leri kademeli olarak artırın. Uygun bir görüş alanı belirlendikten sonra, lazer gücünü 3,6 miliwatt'a ayarlayın.
Ardından tarama bölümüne ilerleyin ve 60 saniye boyunca bir kanal tek görüntü yakalamak için tek tarama'ya tıklayın. Bir kanal iki görüntüsü toplamak için 2P Lazer sekmesine tıklayın ve lazer için 890 nanometre seçin. Filtre küpünü kanal iki emisyon küpü ile değiştirin.
Önizleme modunu başlatın. Güç ölçer yaklaşık yedi miliwatt gösterene ve CFD sayıları 10.000 ile 100.000 arasında olana kadar Pockels'i artırın. Tek taramaya tıklayın ve 60 saniyelik bir süre boyunca bir kanal iki görüntüsü yakalayın.
Hareketsiz nöral kök hücreler ile aktive edilmiş nöral kök hücreleri ayırt etmek için konfokal otofloresan görüntüleme kullanıldı. QNSC'lerin aNSC'lerden daha fazla sayıda PAF gösterdiği bulundu, bu da hücre durumu tanımlaması için bir belirteç olarak otofloresan kullanımını gösterdi. FACS kullanılarak, NSC hücre durumları otofloresansa dayalı olarak zenginleştirildi.
Yüksek otofloresan kapısından sıralanan hücreler, karışık numuneye kıyasla daha düşük bir proliferasyon oranı gösterirken, düşük otofloresan kapısından gelenler daha proliferatif idi ve NSC aktivasyon durumlarının zenginleşmesini doğruladı. Ayrıca, NSC otofloresansını değerlendirmek ve NSC'lerin aktivasyon durumunu ayırt etmek için FLIM kullanıldı. Özellikle, qNSC'ler birinci kanalda daha yüksek bir ortalama floresan ömrü gösterdi, ancak aNSC'lere kıyasla floresan bileşeni alfa olanın daha düşük bir oranı gösterdi.
Her iki kanaldan gelen verileri içeren bir lojistik regresyon modeli, NSC durumlarını sınıflandırmada FLIM'in potansiyelini vurgulayan bir alıcı operatör karakteristik eğrisi ile gösterildiği gibi, NSC aktivasyon durumları için mükemmele yakın bir tahmin kapasitesi sağladı. Bu prosedürü takiben, nöral kök hücre aktivasyon durumunu ölçmek için diğer yaklaşımları kullanarak sonuçları doğrulamak iyi olacaktır.
