Bir kan damarında, endotel hücrelerinin sayısı çok düşüktür, bu da onları incelemeyi zorlaştırır. Protokolümüz bu sınırlamayı ortadan kaldırır ve yeni moleküler yolları ve terapötikleri incelememize izin verir. Protokolümüz, endotelyal zenginleştirilmiş örnekler elde etmemize ve akut ve kronik rahatsız edici akışın bu hücre tipini nasıl etkilediğini incelememize olanak tanır.
Endotel hücrelerini daha ayrıntılı olarak inceleme yeteneği, hedef genleri ve dolayısıyla endotel hücrelerini hedef alan ateroskleroz için potansiyel terapötikleri tanımlamayı mümkün kılar. Karotis arter izolasyonu zordur ve sabır ve deneyim gerektirir. Başlamak için, hayvanı deri altından kilogram buprenorfin başına 0.05 miligram enjekte ederek hazırlayın.
Epilasyonlu bölgeyi Betadine ve izopropanol çözeltisini kullanarak üç kez sterilize edin. Boyun bölgesinde yaklaşık bir santimetrelik ventral orta hat kesisi yapın. Daha sonra LCA dal noktasını künt diseksiyonla ortaya çıkarın.
Sol internal karotid, eksternal karotis ve oksipital arterleri 6-0 sütürlerle bağlayarak superior tiroid artere dokunulmadan bırakılır. Kesiyeri doku yapıştırıcısı veya dikişlerle kapatın. Fareyi 37 santigrat derecede tutulan önceden ısıtılmış bir kurtarma kafesine aktarın.
Ameliyat sonrası hipotermiyi önlemek için fareyi bir saate kadar temiz bir havluya yerleştirin. Kalbin tepesinden sol ventriküle bağlanan IV hattına 21 gauge iğne yerleştirin. Oda sıcaklığında normal salin kullanarak iki ila üç dakika retrograd perfüzyona izin verin.
Bir IV hattı enjekte ederken veya kullanırken sabit bir basınç uygulayarak ve tuzlu su torbasını sekiz ila dokuz fit yükseklikte tutarak sabit bir akış hızını koruyun. Karotis arterleri açığa çıkarmak için cildi boyun bölgesinden tüm yağ, kas ve bağ dokuları ile çıkarın. Daha sonra karotidlerin etrafındaki periadventitial dokuları çıkarın ve karotidi vücuda bağlı bırakın.
Perfüzyona izin vermek için LCA'daki ligasyon bölgesinin altında bir kesi yapın. Herhangi bir kan izini gidermek için LCA'yı sol ventrikülden bir dakika daha perfüze edin. Herhangi bir kan izini gidermek için karotis arterlerin dışını normal salin çözeltisi ile yıkayın.
Sol karotis arterin distal ucunun lümenine 50 mikrolitre sindirim tamponu enjekte etmek için 29 gauge iğneli bir insülin şırıngası kullanın. Sindirim tamponu ile dolu karotis arterin proksimal ucunu sıkıştırmak için bir mikro klips kullanın. Lümenin içine 15 ila 20 mikrolitre sindirim tamponu ekleyin ve sindirim tamponunun salınmasını önlemek için distal ucu klipsleyin.
Karotis arterleri fareden sıcak 37 santigrat derece HEPES Tamponlu Tuzlu Çözeltisi içeren 35 milimetrelik kaplara aktarın. Ve aralıklı sallanma ile 37 santigrat derecede 45 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Luminal enzimatik sindirim tamamlandıktan sonra karotis arteri kelepçelerle 35 milimetrelik çanaktan çıkarın.
Kelepçeleri dikkatlice çıkarın, böylece sindirim tamponu sızmaz. Karotis arterin bir ucunu 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünün üstünde tutun. Bir insülin şırıngası ile donatılmış 29 gauge iğne yerleştirerek lümene 100 mikrolitre sıcak sindirim tamponu ekleyin.
Karotis arterin lümenini mikro santrifüj tüpünde hızla yıkayın, ardından reaksiyonu durdurmak için tüpe 0.3 mikrolitre FBS ekleyin. Mikro santrifüj tüpünü buzun üzerine yerleştirin. Sabit açılı rotorlu bir santrifüj kullanarak hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
Hücreleri, hücre ayrışma reaktifi içeren sindirim tamponunda yeniden askıya alın ve tek hücrelere ayırmak için 37 santigrat derecede beş dakika boyunca inkübe edin. 0,5 mililitrelik tüpe 0,15 mililitre FBS ekleyerek enzimatik reaksiyonu engelleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süper nantantı atın ve hücreleri PBS'deki 100 mikrolitre buz soğuk% 1 BSA çözeltisinde 0.2 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde yeniden askıya alın.
Tek hücre analizi için, peleti 0.2 mililitrelik bir tüp içinde PBS'de 100 mikrolitre buz soğuk% 1 BSA ile yeniden askıya alın. Tek çekirdek analizi için, hücre peletini buz gibi soğuk PBS'de% 0.04 BSA'lık 100 mikrolitrede yeniden askıya alın ve tek hücreli süspansiyonu beş dakika boyunca dört santigrat derecede 500G'de santrifüj edin. Tek hücreli süspansiyonu buz gibi soğuk lizis tamponu ile ayrıştırın ve buz üzerinde beş dakika boyunca inkübe edin.
Lisatı bir P20 pipetle karıştırın ve 10 dakika daha kuluçkaya yatırın. Daha sonra, lizatı 0.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. ly hücrelerini 500 mikrolitre tamponla yıkayın ve bir pipet kullanarak karıştırın.
Ardından santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanı atın ve çekirdek peletini seyreltilmiş çekirdek tamponunun 150 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak tek çekirdek preparatlarını sayın.
Tek çekirdek dizileme çalışmasını takiben, tek hücreli ve tek çekirdekler elde edildi ve parlak alan ve faz kontrast mikroskobu ile görselleştirildi. Tek hücreli süspansiyondan tek çekirdek preparatının etkinliği de gösterilmiştir. Tek hücreli RNA dizileme çalışmasından sonra, hücre başına gen dağılımı, hücre başına benzersiz moleküler tanımlayıcı, hücre başına mitokondriyal okumalar ve dizileme doygunluğu verileri gibi çeşitli parametreler elde edilmiştir.
Tek hücreli ATAC sekans çalışması için, nükleozom bantlama paterni de dahil olmak üzere kesici uç boyutu dağılımı gözlenmiştir. Normalize TSS zenginleştirme skoru da gözlendi. Ek olarak, yüzde parçası zirvelerde okur.
Pik bölge fragmanları, TSS zenginleştirme skoru, kara liste genomik bölgelerindeki okuma oranı ve nükleozom sinyal oranı belirlendi. Enzimatik sindirim hücreler için bir strestir, bu nedenle numuneleri buz üzerinde tutmak ve prosedürü mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirmek çok önemlidir. Bu yöntemi farelerden endotel hücreleri elde etmek ve plakalamak için kullanabiliriz.
Bu tekniği toplu Omix bazlı çalışmalar yapmak için de kullanabiliriz. Bu teknik, bozulmuş kan akışının endotel hücreleri üzerindeki etkisini in vivo olarak tek bir hücre tarzında incelemenin yolunu açtı.
