Tek hücre veya hücre tipleri üzerindeki transkriptom analizi, ayrıntılı hücre içi düzenleyici mekanizmaları ortaya çıkarmak için güçlü bir araç olan heterojenlik tarafından maskelenen gen ekspresyonunun ince farkını tespit edebilir. Floresan ile aktive hücre sıralama ve ardından RN-seq analizi, yüksek transkript algılama hassasiyeti ve diğer multi-omik yaklaşımlarla uyumluluk ile tek hücreli veya toplu hücre tipi modunda gerçekleştirilebilir. Bu protokolün ilk kez kullananların, protoplast sıralama ve RNA-seq kütüphanesi hazırlığındaki bazı adımlara dikkat etmeleri gerekir.
Jun Zhang ile birlikte, laboratuvarımızda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Rongrong Xie, prosedürün gösterilmesinde yardımcı olacaktır. Başlamak için, Arabidopsis thaliana vahşi tip ve floresan işaretleyici hat tohumlarını% 20 ağartıcıya koyun ve tohumları sterilize etmek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dönen bir inkübatör kullanarak inkübe edin. Steril bir tezgahta çalışırken, tohumları çift damıtılmış suda üç ila beş kez durulayın.
Yabani tip ve muhabir hattı tohumlarını yarı mukavemetli MS ortamına hacim agar başına% 0.8 ağırlıkla plakalayın. Bitkileri iki gün boyunca dört santigrat derecede tabakalaştırın. Daha sonra onları beş gün boyunca 16 saatlik ışık ve 18 saatlik karanlık döngüler altında 23 santigrat derecede dikey olarak büyütün.
Deneyden önce buz üzerinde çözelti A ve çözelti B olarak adlandırılan protopkalıcı çözeltileri yavaşça çözün. Kökleri temiz bir bıçak veya makas kullanarak bitkilerden kesin ve kökleri yaklaşık 0,5 santimetre parçalara ayırın. Doğranmış kökleri 1,5 mililitre B çözeltisine batırın ve ardından oda sıcaklığında 1,5 ila 2 saat boyunca hafifçe döndürün.
Elde edilen kök protoplastlarını 40 mikronluk bir süzgeç ağından süzün ve ağı bir ila iki mililitre çözelti ile durulayın A.Santrifüj kombine filtratları 300 G'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı bir pipet kullanarak atın, hücre peletini 500 ila 600 mikrolitre çözelti A'da yeniden askıya alın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Hücre sıralama için, askıya alınmış hücre çözeltisini yeni bir beş mililitrelik test tüpüne aktarın.
Kılıf sıvısı tankını doldurun ve atık tankını kontrol edin. Ardından floresan ile etkinleştirilen hücre sıralama veya FACS makinesini açın. Cihaz kurulumunu ve otomatik kalibrasyon adımlarını ayıklayıcı üzerinde gerçekleştirin.
Floresan kanallarını seçin ve temel kontrol olarak floresan içermeyen vahşi tip bir bitki kullanın. Sıralama kapısını floresan yoğunluğuna ve ileri saçılma ve yan saçılma teklilerine göre ayarlayın. 1.5 mililitrelik bir toplama tüpüne 500 mikrolitre A çözeltisi ekledikten sonra, sıralamaya başlayın ve tüp başına 2.000 ila 3.000 hücre toplayın.
Sıralamadan sonra, örnekleri hemen buzun üzerine yerleştirin. Hücreleri içeren toplama tüpünü 300 G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı bir pipetle çıkarın. İki mikrolitre sıralanmış hücre alın ve floresan mikroskobu kullanarak floresan olup olmadığını kontrol edin.
Sıralanan hücreleri hemen kullanılmazsa eksi 80 santigrat derecede saklayın. Tek hücreli indeks sıralama için, membranlı 96 delikli plakayı adaptöre yerleştirin. Plakanın konumunu, damlacık plakanın orta deliğine düşecek şekilde kalibre edin.
Membranı 96 delikli plakadan çıkarın ve 96 delikli plakayı adaptöre yerleştirin. Sıralama sırasında tek hücreli sıralama modunu seçin. Sıralanan hücrelerin hedef sayısını bir olarak girin ve sıralamaya başlayın.
Deneye başlamadan önce, tezgahı bir yüzey dekontaminantı ve% 75 etanol ile temizleyin. Tüm ekipmanları yalnızca kütüphane hazırlığı sıralamak için kullanın. Sıralanan numuneye bir mikrolitre taze hazırlanmış karışım A ekledikten sonra, steril bir havaneyle öğütün.
RNAse içermeyen su kullanarak, hacmi 14 mikrolitreye çıkarın. Daha sonra her numuneyi 0,2 mililitre ince cidarlı PCR tüpüne aktarın. Daha sonra B karışımını hazırlayın.Numune içeren her PCR tüpüne B karışımına 4,4 mikrolitre ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.
Numuneleri üç dakika boyunca 72 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, oligo dT'yi poli-A kuyruğuna melezlemek için numuneleri hemen buz üzerine koyun. Ters transkripsiyon reaksiyonu karışımını veya C karışımını, numuneleri içeren her bir tüpe 21.6 mikrolitre içinde hazırlayın.
Numuneleri, ters transkripsiyon programı başına ortak bir PCR cihazında ters transkripsiyon reaksiyonuna tabi tutun. Ters transkripsiyon reaksiyonu ürününe taze hazırlanmış ön amplifikasyon reaksiyonu karışımının veya karışım D'nin 40.8 mikrolitresini ekleyin ve ön amplifikasyon programını çalıştırın. Amplifikasyon döngüsü, reaksiyon üstel faza yeni girdiğinde kantitatif PCR ile belirlenebilir.
Ön amplifikasyon reaksiyonu ürünlerini saflaştırmak için, önceden amplifikasyon edilmiş ürünleri bir PCR tüpünden 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Her numuneye 48 mikrolitre AMPure XP boncuk ekleyin ve inkübasyondan önce pipetleme ile hafifçe karıştırın. Numuneleri ve boncukları içeren 1,5 mililitrelik tüpleri beş dakika boyunca manyetik bir ayırma standına yerleştirin.
Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı numunelerden dikkatlice atın. Onları 200 mikrolitre% 80 etanol içinde askıya aldıktan sonra, manyetik ayırma standına üç dakika daha yerleştirin. Süpernatan içeren etanol atıldıktan sonra, numuneleri 10 dakika boyunca bir tüp içinde havayla kurutun.
Boncukları 20 mikrolitre nükleaz içermeyen suda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Sonra onları beş dakika boyunca manyetik ayırma standına yerleştirin. Bir pipet kullanarak, her tüpten 18 mikrolitre süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.
Son olarak, ön kütüphaneyi karakterize etmek için metinde açıklanan adımları izleyin, ardından kütüphane yapımı, saflaştırma ve nicelleştirme izleyin. Floresan Arabidopsis thaliana marker hatları, floresan proteinlerinin özellikle hedef hücre tiplerinde eksprese edilen genlerle kaynaştırılması veya arttırıcı tuzak hatlarının kullanılmasıyla geliştirilmiştir. Floresana özgü işaretli protoplastlar, floresan yoğunluğuna ve ileri saçılma ve yan saçılma teklilerine göre başarıyla sıralandı.
Sıralanan hücreler parlak alan ve floresan görüntüleme kullanılarak görselleştirildi. Yaklaşık 2.000 ksilem kutuplu perisiklus hücresi, lateral kök primordial hücreleri, endodermis veya korteks hücreleri ve lateral kök kapağı hücrelerinden oluşan RNA dizileme kütüphanesinin temsili sonuçları gösterilmiştir. Astar veya adaptör dimer tepe noktalarına sahip küçük boyutlu bir kitaplık, boyut seçiminden sonra da sıralanabilir.
Anormal boyut dağılımına sahip bir kütüphane, kütüphane hazırlığının başarısız olduğunu gösterir. Gen ekspresyon paternleri analiz edildi. Dört kök hücre tipinden herhangi birinde zenginleştirilmiş genler kümelenmiş ve farklı hücre tipleri arasındaki gen ifadelerinin özgüllüğünü gösteren bir ısı haritasında gösterilmiştir.
Doğru geçit ve sıralama yoluyla hedef hücrelerin yüksek kalitesi ve saflığı ve RNA yıkımının önlenmesi, başarılı kütüphane inşasının anahtarıdır. Tek hücre modunda RNA-seq için, son zamanlarda benzersiz moleküler tanımlayıcı ile entegre edilmiş ve performansı önemli ölçüde artıran çeşitli yöntemler bildirilmiştir.
