Bu optimize edilmiş protokol, diyabet için hücre tedavisi için kullanılabilecek ve diyabet biyogenezinin altını çizen moleküler mekanizmaları araştıran insan pluripotent kök hücrelerinden pankreas beta hücresi öncüllerinin üretimini arttırdı. Bu, 2D tek katmanlı kültürler için kullanıldığı için uygulanabilir bir tekniktir. Uygulaması kolaydır ve çoklu kontrol ve hasta kaynaklı pluripotent kök hücre hatları arasında tutarlıdır.
Diyabetik bir hastada nakledildiğinde bu beta hücre öncülleri, insülin salgılayan beta hücrelerine olgunlaşabilir ve potansiyel olarak hiperglisemiyi tersine çevirebilir. Bu nedenle, protokolümüz kullanılarak üretilen pankreas progenitörlerinin artan yüzdeleri, diyabet için hücre tedavisi için kullanılabilir. Bu gelişmiş protokol, sağlıklı bireylerde ve diyabetik hastalarda erken insan pankreas gelişimini incelemek için kullanılabilir, bu da doku örneklerinin yetersizliği nedeniyle zordur.
İnsan pluripotent kök hücresi veya hPSC kolonileri% 70 ila% 80 birleşmeye ulaştığında, doku kültürü başlığı içinde ılık PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra portatif bir vakum aspiratörü kullanarak tamponu aspire edin. Daha sonra, kolonilere CHIR-99021 içeren birinci aşama farklılaşma ortamı ekleyin ve plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, harcanan medyayı CHIR-99021 olmadan birinci aşama farklılaştırma ortamıyla değiştirin. Harcanan ortamı aspire ettikten ve kesin endoderm hücrelerini ılık PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, herhangi bir hücre kalıntılarını çıkarmak için plakayı döndürün. Ardından% 4 paraformaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin ve plakayı iki boyutlu bir çalkalayıcıya yerleştirin.
Fiksasyondan sonra, hücreleri% 0.5 Ara içeren TRIS tamponlu salin ile yıkayın ve plakayı çalkalayıcının üzerine yerleştirin. Daha sonra% 0.5 Triton X-100 içeren cömert miktarda PBS ekleyerek sabit hücreleri geçirgenleştirin ve plakayı çalkalayıcıya geri yerleştirin. Daha sonra, geçirgenleştirilmiş hücrelere taze hazırlanmış bloke edici tampon ekleyin ve plakayı çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra bloke edilmiş hücrelere seyreltilmiş birincil antikorlar ekleyin ve plakayı çalkalayıcıya hafifçe sallayarak dört santigrat derecede yerleştirin. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini aspire ettikten sonra, kuyucukları çalkalayıcıda her biri 10 dakika boyunca TBST ile üç kez yıkayın. Ardından, ikincil antikorları ekleyin.
Işıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile örtün ve plakayı çalkalayıcının üzerine bir saat boyunca oda sıcaklığında yerleştirin. Daha sonra ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve lekeli kuyucukları çalkalayıcı üzerinde TBST ile 10 dakika boyunca yıkayın, plakayı folyo ile kaplı tutun. Daha sonra, çekirdekleri lekelemek için, kuyucuklara Hoechst çözeltisi ekleyin ve plakayı çalkalayıcıya yerleştirin.
İki ila üç dakika sonra, Hoechst çözeltisini aspire edin ve kuyucukları PBS ile iki kez durulayın. Son olarak, lekeli hücrelere PBS ekleyin ve karanlıkta ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak bunları görüntüleyin. İkinci aşamanın birinci gününde, hPSC türevi endodermal hücreleri önce ılık PBS ile yıkayarak ve daha sonra altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuğu başına bir mililitre sıcak enzim çözeltisi ekleyerek ayırın.
Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte üç ila beş dakika boyunca veya hücreler birbirinden ayrılmaya başlayana kadar yerleştirin. Ayrılmış tabakaları veya kuyucuklardaki hücrelerin tek katmanını ayırın ve ayrılmış hücreleri bazal aşama yarım ortam kullanarak 15 mililitrelik bir polipropilen tüp içinde bir araya getirin. Daha sonra hücreleri aşağı doğru döndürün, süpernatanı atın ve bir mililitre steril PBS kullanarak peleti yeniden askıya alın.
Otomatik bir sayaç kullanarak hücreleri saydıktan sonra, hücreleri tekrar döndürün ve süpernatanı atın. Daha sonra peleti, bir Kaya inhibitörü içeren ikinci aşama farklılaşma ortamının uygun hacminde yeniden askıya alın. Askıya alınan hücreleri bir ila 50 membran matris kaplı plakalara yerleştirin ve bunları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
24 saat sonra, ortamı Rock inhibitörü olmadan ikinci aşama farklılaşma ortamı ile değiştirin. Dördüncü aşamanın sonunda, hücreleri daha önce gösterildiği gibi ayırın ve bunları 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Sonra hücreleri döndürün, süpernatanı atın, hücreleri PBS ile yıkayın ve bunları tek hücrelere ayırın.
Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saydıktan sonra, hücreleri tekrar döndürün ve peleti 200 mikrolitre soğutulmuş PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra, iki mililitre soğutulmuş% 80 etanol damlası ekleyin, tüp düşük ila orta hızda ayarlanmış bir vorteks üzerindeyken. Kapağı sıkıca kapatın ve tüpü çalkalayıcının üzerine hafifçe eğilmiş olarak gece boyunca dört santigrat derecede yerleştirin.
Ertesi gün, hücreleri döndürün ve sabit hücre kümelerini ayırmak için peleti PBS ile yıkayın. Ardından, sabit hücreleri oda sıcaklığında en az bir saat veya çalkalayıcıda gece boyunca dört santigrat derece bloke edin. Daha sonra, pankreatik progenitör belirteçlerini boyamak için, 96 kuyucuklu V alt plakada uygun izotip kontrolleri, lekesiz ve ikincil antikor kontrolleri dahil olmak üzere durum başına 200.000 hücre dağıtın.
Ardından plakayı kısaca döndürün ve topakları kaybetmeden süpernatantı atmak için plakayı hızlı bir hareketle çevirin. Daha sonra, hücreleri birincil antikorlarda oda sıcaklığında en az iki saat boyunca hafifçe sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Daha sonra lekeli hücreleri TBST ile üç kez kuyucuklarda yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın.
Hücreleri tekrar santrifüj edin, süpernatanı atın ve hücrelere ikincil antikorlar ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, lekeli hücreleri TBST ile iki kez yıkayın. Ardından plakayı döndürün, lekeli hücreleri ışık korumalı faks tüplerinde 100 mikrolitre PBS'de toplayın ve örnekleri bir akış sitometri makinesinde çalıştırın.
Optimize edilmemiş yöntemle karşılaştırıldığında, optimize edilmiş protokol, PDX 1 ve NKX 6.1 birlikte ekspresyonunu düzenleyerek pankreas progenitör farklılaşma verimliliğini artırdı. Özellikle, endodermal hücrelerin ayrışması ve taze membran matriksi üzerine kaplanması, daha uzun bir evre üçüncü dönem ile birlikte, ayrışmamış protokole kıyasla hPSC türevi pankreas progenitörlerinde NKX 6.1 ekspresyonunu arttırmıştır. Optimize edilmiş protokol kullanılarak üretilen pankreas progenitörleri, ayrışmamış yönteme kıyasla SOX9 pozitif hücre sayısını da arttırdı.
Ayrıca, optimize edilmiş yöntem, proliferasyon belirteci Ki67'yi birlikte ifade eden proliferatif NKX 6.1 pozitif hücrelerin daha yüksek bir oranını da üretti. Verimliliği arttırmak için, HbA1 türevi endodermi ayrıştırmak ve daha sonra FGF amiloid sinyalizasyonu ve Kirpi inhibisyonu ile üçüncü aşama tedavinin süresini uzatmak çok önemlidir. Bu gelişmiş protokolü kullanarak pankreas progenitörlerinin ölçeklenebilir üretimi, insan pluripotent kök hücre kaynaklı pankreas beta hücrelerinin verimliliğini ve olgunlaşmasını artırma çalışmalarını kolaylaştırmış ve farklı diyabet tiplerinin modellenmesine izin vermiştir.
