Lökosit-endotelyal hücre etkileşimleri sepsis gibi inflamatuar hastalıklarda önemli rol oynamaktadır. Enflamasyon disregülasyonu sıklıkla değişmiş vasküler endotel bariyer fonksiyonuna ve aşırı lökosit kaçakçılığına neden olur ve bu da organ hasarına neden olabilir. bMFA dediğimiz biyomimetik mikroakışkan tahlili, in-vivo mikrovasküler ağların topografyasını ve akış koşullarını yeniden üretir ve nötrofillerin yuvarlanma, sıkı yapışma, yayılma ve doku bölmesine göçünün gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesine izin verir.
Biyomimetik mikroakışkan tahlilin bir gücü, klinik translasyonu arttırmak ve potansiyel terapötikleri hızlı bir şekilde taramak için birincil insan hücrelerini ve klinik olarak ilgili hasta örneklerini kullanma yeteneğidir. Prosedürleri gösteren, laboratuvarımdan mezun bir araştırma asistanı olan Bay Qingliang Yang olacak. Bir giriş portu hariç, ince forseps kullanarak portların içine yaklaşık bir inç uzunluğundaki tüpü yerleştirmeye başlayın.
Çene kelepçelerini kullanarak, iki çıkış portunu ve doku bölmesini birbirine kenetleyin. Fibronektin stok çözeltisini PBS ile mililitre başına 100 mikrograma kadar seyreltin. Seyreltilmiş fibronektin çözeltisi ile 24 gauge künt iğneye bağlı bir mililitrelik bir şırınga yükleyin ve şırıngayı dört inç uzunluğundaki bir boruya bağlayın.
Boruyu açık giriş portuna yerleştirin, ardından insan fibronektininin başka bir giriş portundan serbest bırakılana kadar pistonu itin ve kelepçeleyin. Tüm kanallar, doku bölmesi ve borular insan fibronektin çözeltisi ile dolana kadar kalan portlar için işlemi tekrarlayın. İğneyi çıkarın, ancak dört inç uzunluğundaki boruyu takılı ve açılmamış halde tutun.
Gazdan arındırma işlemini gerçekleştirmek için, kapaksız boruyu, 15 dakika boyunca inç kare başına beş pound basınçla sıkıştırılmış bir azot tankına bağlı pnömatik astara bağlayın. Mikroskop altında, kanal veya doku bölmesi içinde sıkışmış hava kabarcığı olmadığını kontrol edin ve hava kabarcıkları varsa cihazı yeniden bağlayın. Cihazı pnömatik astardan çıkarın ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Önceden ısıtılmış insan akciğeri mikrovasküler endotel hücre kültürü ortamını kullanarak, tüm kanalları ve doku bölmesini yıkayın. Metin yazısında açıklandığı gibi endotel hücrelerini topladıktan sonra, programlanabilir şırınga pompasını G.In 150 kez beş dakika boyunca santrifüjleme yoluyla hücreleri peletleyin, bir mililitrelik bir şırınga takın ve tüpü künt iğneye takın. Şırınga namlusuna girmesine izin vermeden yaklaşık 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu boruya çekin.
Kelepçeyi cihazın çıkış portundan çıkarın. Kanala herhangi bir hava kabarcığı sokmadan boruyu giriş portuna bağlayın. Pompayı dakikada dört ila sekiz mikrolitre akış hızıyla durdurun ve mikroskop altında gözlemleyin.
Kanallar hücrelerle doldurulduğunda pompayı durdurun. Çıkışı kelepçeleyin ve giriş borusunu kesin. Cihazı% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübatöre yerleştirin.
Dört saatlik inkübasyondan sonra, başka bir şırınga hazırlayın ve taze hücre kültürü ortamı ile doldurun. Şırıngayı bir şırınga pompasına monte edin ve giriş portuna bağlayın. Kelepçeyi çıkış portundan çıkarın.
Yüzen veya bağlanmamış hücreleri çıkarmak için taze medyayı dakikada dört ila sekiz mikrolitrede yaklaşık beş dakika boyunca cihazdan geçirin. Taze hücre kültürü ortamı ile doldurarak bir şırınga hazırlayın. Şırıngayı bir şırınga pompasına monte edin ve çıkış portunu açık tutarken bir giriş portuna bağlayın.
Cihazı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre yerleştirin. Şırınga pompasını, metin yazısında açıklandığı gibi akış altındaki endotel hücrelerini kültürlemek için programlayın. Bir mikroskop kullanarak, akış altında 48 saatlik kültürden sonra bMFA'yı kontrol edin.
Konfokal mikroskopi, vasküler kanalların tüm yüzeylerinin endotel hücreleri tarafından kaplandığını ve bMFA'da tam bir 3D lümen oluşturduğunu gösterdi. Üç farklı bMFA cihazı hazırladıktan sonra, endotel hücrelerini ve nötrofilleri uyarmak için TNF-alfa ve inflamatuar sitokinin kullanıldığı PKC delta inhibitörü ile kombine edilmiş hücre kültürü ortamı veya TNF-alfa veya TNF-alfa ile üç adet bir mililitrelik şırınga yükleyin. PKC delta inhibitörü yeni bir antiinflamatuar inhibitördür.
Yüklü üç şırıngayı üç bMFA cihazına bağlayın. Tampon TNF-alfa veya TNF-alfa ilave inhibitör kullanarak, insan akciğer mikrovasküler endotel hücrelerini dakikada 0.1 mikrolitrede dört saat boyunca tedavi edin. Metin makalesinde açıklandığı gibi insan nötrofillerini izole ettikten sonra, nötrofilleri 999 mikrolitre HEPES tamponunda yeniden askıya alın ve süspansiyona bir mikrolitre 10 milimolar CFDA SE boya stok çözeltisi ekleyin, bu da CFDA SE'nin 10 mikromolar çalışma çözeltisi ile sonuçlanır ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
Çözeltiyi 315 kez G.'de beş dakika boyunca santrifüj ederek hücreleri iki kez HEPES tamponu ile yıkayın.Hücreleri saydıktan sonra, hücre kültürü ortamında mililitre başına 2 milyon nötrofilde veya PKC delta inhibitörü ile eklenen TNF-alfa veya TNF-alfa'da yeniden askıya alın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Şırıngayı, hücre kültürü ortamında hazırlanan kemo-çekici, fMLP'nin bir mikromolar ile doldurun. bMFA'nın bir giriş ve çıkış portunu açın.
Portu boruyu doku bölmesinden çıkarın ve fMLP borusunu takın. Tüm bMFA'lar için doku bölmesine yaklaşık 20 mikrolitre fMLP enjekte edin ve hücre kültürü ortamı ile tedavi edileni bırakın. Boruyu kesin ve kelepçeleyin.
Şırıngayı yaklaşık 200 mikrolitre nötrofil süspansiyonu ile doldurun ve şırıngayı şırınga pompasına monte edin. Cihazı ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına yerleştirdikten sonra, akış hızını dakikada bir mikrolitreye ayarlayın ve pompayı çalıştırın. Nötrofil süspansiyonunun küçük bir damlası borudan çıkana kadar bekleyin ve boruyu giriş portuna yerleştirin.
Floresan etiketli nötrofiller vasküler kanallara akar ve endotel hücreleri ve fizyolojik olarak ilgili akış koşulları ile etkileşime girer. Deneye başladıktan 10 dakika sonra, görüntü analiz yazılımını açın, objektif lensi 10x'e değiştirin ve cihazı mikroskop altında ortalamak için sahne joystick'ini kullanın. Yapışma haritasını edinmek için, Al'a gidin, Büyük Resmi Tara'yı tıklatın.
Yeni bir pencere açılır. 10x Hedef lensi seçin ve alan seçeneğini ayarlayın, örneğin, 5 x 3. Tara'yı tıklatın, Dosya'yı tıklatın ve yapışma haritasını kaydedin.
Geçiş analizi için geçiş haritasını elde etmek üzere sahne alanı joystick'ini kullanarak cihazı mikroskop altında ortalayın. Görüntüle, Edinme Denetimleri, ND Alımı'na tıklayın. Yeni bir pencere açılır.
Dosyayı kaydetmek için Yol'u ayarlayın ve dosya adını yazın. Büyük Görüntü işlevini kontrol edin, Tarama Alanı'nı ayarlayın, örneğin, 5 x 3. Zaman işlevini kontrol edin, Aralık'ı beş dakika ve Süre'yi 60 dakika olarak ayarlayın.
Doku bölmesinin hızlandırılmış görüntülerini alın ve sonraki saat boyunca her beş dakikada bir görüntü alın. CFD simülasyonu, akış deseninin bozulduğu çatallanma alanları hariç, vasküler kanallardaki laminer akış modelini gösterir. Biyomimetik mikroakışkan testi yapıldıktan sonra, faz kontrast görüntüleri, vasküler kanalların yüzeylerinin endotel hücreleri ile kaplandığını ve 48 saatlik kültürden sonra kesme akışı yönünde hizalandığını ortaya koydu.
Floresan görüntüleme, endotel hücrelerinin bMFA'da tam bir üç boyutlu lümen oluşturduğunu gösteren konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirildi Bir nötrofil adezyon haritası elde edildi ve bu da bMFA'da nötrofillerin endotel hücrelerine önemli ölçüde yapıştığını ortaya koydu. bMFA'daki nötrofil migrasyon haritası, TNF-alfa aktivasyonu üzerine, nötrofillerin doku bölmesi içinde önemli miktarda göçünün meydana geldiğini, TNF-alfa aktivasyonu olmadan böyle bir göçün gözlenmediğini ortaya koymuştur. Nötrofillerin mekansal dağılımını kesme hızıyla ilişkilendiren bir yapışma haritası, nötrofil yapışmasının düşük kesme oranına sahip kaplarda ve çatallanma bölgelerine yakın yerlerde tercihen meydana geldiğini göstermiştir.
Ayrıca, TNF-alfa tedavisi, PKC delta inhibitörü ile inhibe edilen adezyonu önemli ölçüde arttırır. Hızlandırılmış görüntülerin analizi, endotel hücrelerinin TNF aktivasyonunun fMLP'ye yanıt olarak nötrofil göçünü arttırdığını, PKC delta inhibitörü ile tedavinin TNF-alfa ile tedavi edilen hücrelere kıyasla göçü azalttığını göstermiştir. Bu nedenle, bMFA, enflamatuar hastalığın tedavisi için yeni bir terapinin etkinliğini test etmek için kullanılabilir.
bMFA ayrıca geçirgenlik ve trans-endotel elektrik direnci, TEER olarak adlandırılan ve inflamasyon sırasında adezyon molekülü ekspresyonu gibi değişkenleri ölçerek endotel bütünlüğünü incelemek için de kullanılabilir. Biyomimetik mikroakışkan tahlil, farklı organların mikro çevresini taklit edebilir ve tek hücre tipleri veya türleriyle sınırlı değildir ve ayrıca organ fonksiyonu için kritik olan hücre / hücre iletişimini modelleyebilir ve farklı hastalıkları modelleyebilir.
