Bu çalışmada, Victoria Hükümeti OIS Programı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya, program ve proje hibeleri (Toz-JPF Chin) ve yüksek lisans bursu (D Michell) tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Karotid arterlerin görme <ol><li> CO 2 / O 2 boğulma yoluyla Euthanase10 hafta eski Sprague Dawley rat. </li><li> Gemilerin minimum esneme sağlamak Vergi aort ve kalp ile sağ ve sol karotis arterler. </li><li> Buz Krebs tampon karotid arterler aorta ve kalp ayrı ve yakın diseksiyon. </li><li> Monte etmeden önce buz üzerinde Krebs izole damarlarda tutun. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 45 dakika 2. Astar geminin kamara <ol><li> 37 tampon aracılığıyla ° C; carbogen gaz (% 5 CO 2% 95 O 2) beslerken fizyolojik pH muhafaza geminin kamara floş Krebs tampon proksimal ve distal konektörlerdeki </li><li> Tüp olun ve kanüller tamamen kızardı ve hizalanır. </li><li> Krebs tampon (proksimal) P1 ve P2 (distal) dönüştürücüler ile yıkayın. Dönüştürücüler içinde hava kabarcıkları sağlamak için Kapat musluklar. </li><li> Dönüştürücüler gelen konektörlere bağlayın ve hiç hava kabarcığı sağlamak daha Krebs tampon tekrar yıkayın. Odaya musluğu açıp kapatın. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 15 dakika 3. Geminin kamara basınçlandırma <ol><li> Basınçlı ekipmanlar açın: basınç servo, basınç monitörü, peristaltik pompa (Şekil 1). </li><li> Hiç hava kabarcığı sağlamak 20 mmHg (1 arama), tüp aracılığıyla otomatik çalıştırmak Krebs tampon baskı ve basınç servo peristaltik pompa ile. </li><li> Kapalı P2 dönüştürücü boru bağlayın. Basınç kararlı hale gelecektir. </li><li> Kabarcıkları sonra kapatabilir dışarı atılması için geminin odasına P2 musluğu açın. </li><li> Krebs tamponu (5 - 7 ml) ile banyo doldurun. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 10 dakika 4. Montaj gemi <ol><li> Her kanül üzerine bir diseksiyon mikroskobu yer siyah polyester bağları (Şekil 2) altında. </li><li> Kanüller ve kanül sahipleri dışında hareket ettirin ve montaj ¼ P1 kanül üzerine damar (aort kemer sonu). Geminin gözyaşı olun. </li><li> Krebs tamponu ile dolu bir şırınga kullanarak yavaşça P1 transdüser aracılığı ile geminin aşırı kan dışarı floş. Odasına P1 kapatın. </li><li> Polyester kravat P1 kanül Güvenli gemi. </li><li> P2 kanül üzerine montaj için kanüller / yakın kanül sahipleri taşıyın. </li><li> Mount gemi distal ucu (~ ¼ uzunluğu) distal kanül üzerine. Polyester kravat ile sabitleyin. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 20 dakika 5. Gemi basınçlandırma <ol><li> Geminin herhangi bir bükülme veya streç sağlamak için kanül sahipleri ayarlayın. </li><li> P1 ve P2 odasının kapalı basınç servo manuel otomatik geçiş yapar. 10 saniye içinde basıncı sürekli bir azalma var basınç servo kontrol edin. Varsa, bir sızıntı meydana geliyor ve bağlantıları ve dönüştürücüler yerde güvenli olması gerekir. </li><li> Geri basınç odasına otomatik olarak sonra açık P2 servo ayarlayın. Mikroskop altında odasına musluk açıldığında damar genişler gözlemliyoruz. </li><li> Kılavuzuna basınç servo geçin. 10 saniye içinde basıncı sürekli bir düşüş için tekrar kontrol edin. Bir sızıntı varsa sonra sistem sıkı baskı ve geminin bir delik olması muhtemel değildir. </li><li> Otomatik açık P1 odasına geri dönün. Manuel ayar basıncı sabit kalır olduğunu kontrol edin. </li><li> Eğer herhangi bir sızıntı, manuel ayar artış kadran 2 (40 mmHg). </li><li> Otomatik olarak ayarlayın ve mikroskop altında damar dikkat. Gerekirse, manuel ayar sızıntıları vessel.Check hiçbir bend sağlamak için kanül sahibinin ayarlayın. </li><li> 5.7 istenen basınç ulaşana kadar 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) ve çevirmeli artan adımları 5.6 tekrarlayın. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 15 - 30 dakika 6. Basınçlı gemi kuluçka <ol><li> Sıcaklık kontrolörü seti - 37 ° C bağlayın </li><li> Damar odasının banyo içine ikinci bir peristaltik pompa serpmek Krebs tampon (1 ml / dk). </li><li> Banyo sadece üst katmanı sağlamak odasına aspiratör kaldırılır bağlayın. </li><li> Basınçlı kap, otomatik olarak ayarlanan basınç ile 1 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Basıncı periyodik olarak (otomatik geçiş) sızıntı değildir kontrol edin. </li><li> Sadece inkübasyon sırasında banyo bileşik ekleyerek çeşitli farmakolojik müdahalelerin etkileri görülebilir. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 1 saat 7. Basınçlı kap tam kan ile perfüze <ol><li> İnkübasyon sırasında en az 7.5 ml insan tam kan / 40 U heparin / ml kan toplanan gemi edinin. 50 ml şahin kuluçkaya 37 ° C. </li><li> T 10 dakika önce37 ° de 10 dakika VybrantDil (1:1000) ile kuluçka etiket kan ° C karanlıkta. </li><li> 10 dakika sonra, bir şırınga kabarcıkları temizleyerek, kan toplama ve 37 olarak belirlenmiş bir ısı ceketi ° C ile bir şırınga pompası üzerine eklemek </li><li> P1 transdüser Kapatma odası / gemi ve şırınga ve atık tüp bağlayın. </li><li> 1000 mcL / atık boru aracılığıyla herhangi bir kabarcıkları dakika Temizle kan. </li><li> P1 odasına açın. Basınç servo istenen basıncı sağlamak için otomatik olarak ayarlanır. </li><li> 100 mcL / dak kan serpmek. </li><li> Bir dijital kamera kayıt 1 perfüze geminin 15 saniye boyunca iki alan, 3, 5, 7.5 ve 10 dakika birleştiğinde bir floresan mikroskop kullanarak. </li><li> Perfüzyon endotel bütünlüğü ve fonksiyonu gibi inflamatuvar yanıtı daha doğrulamak için myograph ve adezyon molekülü ekspresyonu immünohistokimyasal olarak tespit edilebilir gibi farmakolojik teknikler ile tespit edilebilir. </li></ol> Yaklaşık. süresi = 15 dakika 8. Temsilcisi Sonuçlar: Basınç odasının kurulum şematik diyagramı Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Floresan mikroskop sonuçları bir dijital kamera canlı video kayıtları üzerinden anında görüntülenebilmekte. Temsilcisi video görüntüleri lökosit 10 saniye boyunca sabit kaldı endotel yapışık olarak kabul edilir Şekil 3&#39;te görülmektedir. Sürekli bir döngü yapıştırılır hücreleri üzerinde video kayıtları ile bir başına ortalama alanı olarak sayılabilir. , Hem de düşük (Şekil 3A) ve yüksek basınç (Şekil 3B) yapışma bir miktar neden olsa da yüksek intraluminal basınç lökosit adezyonu önemli bir artış görülür ve bu da kantitatif olarak gösterilmiştir (Şekil 4) . <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> Şekil 1. Basınçlı ex vivo geminin kamara şematik bir proksimal (P1), damar içinde manipüle kan basıncı sağlayan bir dönüştürücü ve distal (P2) dönüştürücüler bağlı kanüle bir gemi . Perfüzyon P1 dönüştürücü ve basınç yoluyla P2 transdüser ile korunur. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> Şekil 2. Bağları olan Cannuala Siyah polyester bağları her kanül bağlıdırlar. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> Şekil 3. Temsilci video görüntüleri 80 mmHg (A) ve 120 mmHg altında floresans Dinamik hücre adezyon (kırmızı ok) (B) perfüzyon 10 dakika sonra. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> Şekil 4, 1 saat düşük inkübasyon (80 mmHg) ve yüksek basınç (120 mmHg) sonra Sprague Dawley Lökosit yapışma arterler karotid . *** P &lt;0.001, Bonferroni post hoc testi kullanılarak 2-yönlü tekrarlayan ölçümler ANOVA ile analiz gibi.

<ol>
	<li>Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+burden+of+disease+and+risk+factors.">Global and regional burden of disease and risk factors.</a> Lancet. 367, 1747-1757 (2001).</li><li>Szczech, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+kidney+injury+and+cardiovascular+outcomes+in+acute+severe+hypertension.">Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension.</a> Circulation. 121, 2183-2191 .</li><li>Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+elevated+blood+pressure+and+its+management+on+the+short-term+outcome+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke.</a> Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).</li><li>Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+from+hypertension+to+congestive+heart+failure.">The progression from hypertension to congestive heart failure.</a> JAMA. 275, 1557-1562 (1996).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Riou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+pressure+promotes+monocyte+adhesion+to+the+vascular+wall.">High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall.</a> Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).</li><li>Ley, K., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial,+not+hemodynamic,+differences+are+responsible+for+preferential+leukocyte+rolling+in+rat+mesenteric+venules.+Circ+Res.">Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res.</a> 69, 1034-1041 (1991).</li><li>Bernhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIF+is+a+noncognate+ligand+of+CXC+chemokine+receptors+in+inflammatory+and+atherogenic+cell+recruitment.">MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment.</a> Nat Med. 13, 587-596 (2007).</li><li>Woollard, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+levels+of+soluble+P-selectin+mediate+adhesion+of+leukocytes+to+the+endothelium+through+Mac-1+activation.">Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation.</a> Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).</li><li>Eberth, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+pulsatility+in+hypertensive+carotid+artery+growth+and+remodeling.">Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling.</a> J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).</li><li>Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+activates+an+endothelial+potassium+channel+to+release+an+endogenous+nitrovasodilator.">Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator.</a> J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).</li></ol>

Çalışma protokolü Alfred Tıbbi Araştırma ve Eğitim Precinct Hayvan Etik Kurulu ve Alfred Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı.

Bu, gerçek zamanlı olarak basınçlı koşullar altında bozulmadan izole kan damarlarının endotele lökosit adezyonu incelemek için modifiye edilmiş bir yöntemdir. Perfüzyon yalnız geminin odası, büyük fare ve sıçan damarları pro-inflamatuar suşlarının hızlı bir doğrulama sağlar. Etkinleştirilmesi basınç manipülasyon dinamik hücre etkileşimleri böylece daha iyi taklit-fizyolojik çok yüksek intraluminal basıncı ve fizyopatolojik koşullardaki düşük uyulması gereken sağlar. Damarların çapı da yeterli hücre görüntüleme programı kullanarak ve bu nedenle kayma akışı ve hızı belirlenir ve bu yüzden manipüle edilebilir ölçülebilir. Kendi myograph yetenekleri ile, banyo yerleştirilir farmakolojik müdahaleler, mekanik ve sinyalizasyon yolaklar çalışmaları sağlayan bu model ile deneysel koşullar altında mümkün olan başka bir boyut ekleyin. Endotel korunması basınç manipülasyon sırasında teyit mümkün olmasa bile, ACh ve PE yanıtları yazılan perfüzyon 9 yapılabilir. Bu kurulum hücre-hücre etkileşimleri pulsatil kan akımı, ne de sistolik ve diyastolik kan basıncı etkileri intraluminal basınç etkilerini göstermektedir dikkat edilmelidir. Ayrıca, lökosit adezyonu akut basınç değişiklikleri gözlenirken, bu kurulum da kronik basınç etkileri (yani artan inkübasyon sürelerinde ve kronik basınç hayvan modeli kullanarak) bakmak için kullanılan olabilir. Sprague Dawley karotis arterler bu set göstermiştir ama diğer suşları ve tür kanül boyutuna uygun düzenlemeler ile kullanılıyor olabilir. Gerçekten de, hayvanların yaş ve ağırlık seti kadar her gemi için bireyselleştirilmiş gerektiğini, böylece damar çapı etkiler ve dikkat etmek önemlidir. Bağ dokusu yakın ve dikkatli bir diseksiyon derece lökositlerin görselleştirme artırabilir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / ekipman Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, Inc. </td><td> Stereo Discovery V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 Şırınga Pompa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> Dijital Kamera ve Denetleyici </td><td> Hamamatsu ORCA-ER </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Aydınlatma Sistemi </td><td> Lümen Dynamics </td><td> X-Cite 120 </td><td></td></tr><tr><td> Gemi Odası </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> Basınç Servo Controller ve Peristaltik Pompa </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> PS-200 </td><td></td></tr><tr><td> Perfüzyon basıncı Monitor </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 x Basınç Transducer </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> PT - F </td><td></td></tr><tr><td> Sıcaklık Kontrolör </td><td> Oturma Sistemleri Enstrümantasyon </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltik Pompa </td><td> Instech Laboratories, Inc. </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil hücre-etiketleme çözümü </td><td> Invitrogen </td><td> V-22885 </td><td> 1:1000 kullanın. </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

Dünya çapında, hipertansiyon, nüfusun yaklaşık dörtte biri olması için bildirilen ve mortalite dünya çapında önde gelen biyomedikal risk faktörü. Vasküler hipertansiyon, endotel disfonksiyonu ve ateroskleroz ve 2 kronik böbrek hastalığı, felç 3 ve 4 kalp yetmezliği gibi çeşitli hastalık durumlarında önde gelen artış inflamasyon ile ilişkili . Bir ilk adım aterogenez yol açan vasküler inflamasyon, endotel ile yuvarlanma, bağlama, bağlılık ve lökositlerin sonraki göçüne içeren yapışma kaskad. İşe Alım ve lökositlerin endotele birikimi vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1), hücre içi hücre adezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve E-selektin gibi artar gibi adezyon moleküllerinin bir upregülasyonu aracılı sitokin ve kemokin serbest bırakılması ve reaktif oksijen türlerinin bir upregülasyonu 5 in vitro yöntemleri gibi statik yapışma deneyleri, hücre-hücre adezyon yer mekanizmalarının yanı sıra hücre adezyon moleküllerinin analiz belirlemek için yardımcı olur . In vitro çalışmalar önceki istihdam Yöntemleri endotel üzerindeki akut basınç artar monosit adezyonu, adezyon molekülleri ve inflamatuvar belirteçler 6 Bununla birlikte, in vitro tayinlerde çok benzer, bu bulgular, gerçek zamanlı olarak yapılmış değil bir upregülasyonu yol açabileceğini göstermiştir fizyolojik akış koşulları altında, ne de tam kan. Bu nedenle, in vivo testleri giderek vasküler inflamasyon ve plak gelişimi göstermek için hayvan modellerinde kullanılmaktadır. Intravital mikroskopi artık yaygın lökosit adezyonu, haddeleme, göç ve göçüne 7-9 değerlendirmek için kullanılır. In vivo çalışmalar, endotelyal adezyon lökosit üzerinde basınç etkilerini birleştirerek daha geniş. Böyle bir çalışmada sadece 10 immünhistokimya ile değerlendirildi arteriyel büyüme ve remodeling ama inflamatuvar belirteçler kayma akışı ve gerçek zamanlı etkileri inceler. Burada bozulmamış basınçlı kan damarları tam kan perfüzyon kullanarak gerçek zamanlı lökosit adezyonu kayıt için bir model sunuyoruz. Metodolojisi, sağlam damarlarında lökosit-endotel yapıştırıcı etkileşimleri gerçek zamanlı analiz sağlayan bir ex vivo geminin kamara perfüzyon modeli 9 bir değişiklik . Bizim değişiklik intraluminal basınç 200 mmHg sadece fizyolojik akış koşulları değil, aynı zamanda basınç şartları altında çalışması için izin manipülasyon sağlar. Basıncı kasılmaların kâğıda çizilmesi sistemleri daha önce damar duvar ve lümen çapı 11 gibi damar daralma gözlemlemek için gösterilmiş olsa da bu gerçek zamanlı olarak lökosit leşimlerini gösteren ilk kez . Burada sıçanlardan alınan hasat ve floresan mikroskop birleştiğinde bir ölçüye göre akış odasına kanüle karotid arterler kullanılarak tekniği göstermektedir. Geminin kamara görüntü gemi kısa çalışma mesafesi ile geniş çaplı bir objektif lens sağlayan büyük bir alt coverglass ile donatılmıştır. Ayrıca, seçilen agonist ve / veya antagonistleri daha fazla hücre adezyon kontrol mekanizmalarının araştırılması için kullanılabilir. Intravital mikroskopi üzerinden bu yöntemin avantajları invaziv cerrahi hiçbir ilgisi ve bu nedenle daha yüksek bir verim elde edilebilir. Intravital sadece sistemik inhibitörü tedavisi sağlar iken Bu yöntem aynı zamanda istenen gemi lokalize inhibitörü tedavisi kullanımını mümkün kılar.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure at JoVE.com

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Bu hasat basınçlı kaplar endotele lökosit yapışma görselleştirmek için bir yöntemdir. Bu teknik, bu nedenle yüksek kan basıncı fizyopatolojik koşullardaki taklit-200 mmHg intralüminal basınca kadar farklı kayma akışı altında vasküler yapışma eğitimi sağlar.

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

imaging-leukocyte-adhesion-to-vascular-endothelium-at-high

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Görüntüleme.  Monash University. Bu hasat basınçlı kaplar endotele lökosit yapışma görselleştirmek için bir yöntemdir. Bu teknik, bu nedenle yüksek kan basıncı fizyopatolojik koşullardaki taklit-200 mmHg intralüminal basınca kadar farklı kayma akışı altında vasküler yapışma eğitimi sağlar.

Video: Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Farelerde mesenteriumda Damarlardaki intravital Mikroskopi Lökosit-endotelyal ve Trombosit-lökosit Etkileşimleri

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...