Meme bezi oldukça dinamiktir ve yaşam boyunca birçok yeniden yapılanma turuna uğrar. Protokolümüz, sağlıklı ve hastalıklı meme bezindeki doku yeniden düzenlemelerini yönlendiren hücresel dinamikleri yakalamaya izin verir. Değiştirilebilir kapaklı meme görüntüleme penceremiz, meme bezinin uzunlamasına intravital görüntülemesinin birkaç haftaya kadar uzun süreler boyunca gerçekleştirilmesini sağlar.
Meme görüntüleme penceresinin değiştirilebilir kapağı, her zaman optimum görüntüleme koşulları sağlar ve görüntüleme seansları arasında doku manipülasyonuna veya ilaç uygulamasına izin verir. Yöntemimiz sadece sağlıklı meme bezi biyolojisi hakkında fikir vermekle kalmaz, aynı zamanda meme tümörünün başlamasını ve ilerlemesini tek hücre düzeyinde incelememize izin verir. Meme görüntüleme penceresinin kapağını steril bir yüzeye yerleştirerek ve tüm jant kapağı çevresine siyanoakrilat yapışkan yapıştırıcı uygulayarak başlayın.
Kapağın üstüne 10 milimetrelik yuvarlak bir cam kapak kaymasını dikkatlice yerleştirin. Cam kapak kaymasını konumlandırmak için steril bir ahşap çubuk kullanın ve cam kapak kayması ile kapağın çerçevesi arasında hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için aşağı itmek üzere biraz kuvvet uygulayın. Camın kapağın kollarındaki delikleri örtmediğinden emin olun.
Kapakları ve meme görüntüleme penceresini kapalı bir Petri kabında en az 30 dakika boyunca% 80 etanol içine batırarak dezenfekte edin. Cam kapak kayması üzerindeki fazla siyanoakrilat yapışkan yapıştırıcıyı çıkarmak için asetona batırılmış bir pamuk ucu kullanın. Fareyi ameliyata hazırlamak için, dördüncü meme bezinin etrafındaki alanı bir tıraş bıçağı kullanarak tıraş edin.
Dördüncü meme ucunu bir dönüm noktası olarak kullanın ve yapışkan bant kullanarak gevşek tüyleri çıkarın. Hayvanın yeterince uyuşturulup uyuşturulmadığını doğrulamak için bir pençe çekme testi yapın. İnce Graefe forseps kullanarak cildi nazikçe kaldırın ve dördüncü meme yağ yastığının üstündeki ciltte 10 ila 15 milimetrelik diyagonal bir kesi yapmak için küçük yaylı makas kullanın Dördüncü meme ucunu bir oryantasyon noktası olarak kullanın ve periton veya meme bezini kesmediğinizden veya zarar vermediğinizden emin olun.
Meme görüntüleme penceresi çerçevesine uyacak bir cep oluşturmak için insizyon çizgisinin her yerinde beş ila sekiz milimetreye kadar künt diseksiyon kullanarak cildi meme yağ yastığından ve altta yatan doku katmanlarından ayırın. Lenf nodu veya tümör lezyonunun yeri de dahil olmak üzere meme dokusunun makroskopik özelliklerine dayanarak ilgi alanını veya ROI'yi tanımlayın. Kesi ile ilgili olarak ROI'yi merkezi tutmaya çalışın.
Steril forseps kullanarak meme görüntüleme penceresini alın ve insizyonun pencereyi yerleştirecek kadar büyük olup olmadığını test edin. Gerekirse, meme görüntüleme penceresi oturana kadar insizyonu hafifçe büyütün. Pencereyi çıkarın ve kaudal uçtan başlayarak ve cildin dışından içine doğru insizyonun kenarından bir ila iki milimetre uzağa bir çanta ipi dikişi yerleştirmek için 5-0 ipek dikiş kullanın.
Kesi boyunca yaklaşık beş milimetre yukarı doğru hareket ettirin ve dikiş ipliğini deriden içeriden dışarıya doğru geçirin. Bu prosedürü insizyonun kenarı boyunca tekrarlayın, böylece beş ila altı döngüden oluşan dairesel bir dikiş oluşturun. Dikiş ipliğinin son çıkışı, ilk girişten yaklaşık iki ila beş milimetre uzağa yerleştirilmelidir.
Meme görüntüleme penceresini insizyonun içine yerleştirin ve cildi pencerenin oluğuna dikkatlice yerleştirmek için Graefe forsepslerini kullanın. Dikişin halkalarını dışarıda bıraktığınızdan emin olun. Çanta ipi dikişinin halkalarını çekin ve meme görüntüleme penceresinin oluğunda sıkmak için dikişin her iki ucunu da yavaşça çekin.
Cerrahi düğümlerle bağlayın ve fazla ipliği kesin. Petrol jölesini pencerenin iç kenarına uygulamak için bir kürdan kullanın ve altta yatan dokudan kaçının. Steril forseps ile pencere çerçevesini yavaşça aşağı doğru itin ve kapağı pencere çerçevesine yerleştirin.
Bu, meme bezi dokusu ile meme görüntüleme penceresi kapağı arasında bir hava hacmini önleyecektir. İnce forsepslerin uçlarını kapağın kollarındaki deliklerden geçirin ve kapağı saat yönünde bükerek sıkın. Kapağı sıktıktan sonra biraz hava kalırsa, deriden meme dokusu ile kapak arasındaki boşluğa steril bir insülin iğnesi sokun ve pistonu yavaşça çekin, böylece meme bezi dokusu ile meme görüntüleme penceresi kapağı arasında bir boşluk oluşturun.
Şimdi lenf nodu bu işlemden sonra kolayca gözlemlenebilir. Meme görüntüleme penceresi çerçevesinin ve kapağın durumunu, dikişlerin stabilitesi veya kapaktaki olası hasarlar dahil olmak üzere kontrol edin. Fareyi, meme görüntüleme penceresinin görüntüleme kutusu kakmasının deliğine düşeceği şekilde kakma üzerine getirin.
Fareyi stabilize etmek ve solunum nedeniyle doku hareketini azaltmak için farenin arkasına yarı saydam ve kağıt bant uygulayın. Üç saatten uzun süren görüntüleme oturumlarında, esnek bir iğneyi farenin boynuna deri altından yerleştirin ve kağıt bantla sabitleyin. Esnek bir silikon tüpe bir besin karışımı ile 10 milimetrelik bir şırınga takın ve besin karışımını tüpün sonuna ulaşana kadar itin.
Silikon tüpü esnek iğneye bağlayın ve her 30 dakikada bir demlenmiş çözeltinin 50 mikrolitresini enjekte edin. Kapatmak için kapağı görüntüleme kutusunun üzerine yerleştirin. Ardından, görüntüleme kutusunu mikroskop aşamasında sabitleyin.
Farenin görüntüleme kutusunun içinde sabit olduğunu doğrulayın. Mikroskobun epifloresan modunu kullanarak ilgi alanını tanımlayın ve mikroskop ayarlarını uygulayın. Büyük bir genel bakış karo taraması oluşturmak ve dokunun referans haritasını oluşturmak için görüntüleme yazılımı gezgini modunda Spiral işlevini kullanın.
Spiral genel bakış içinde ilgi alanlarını tanımlayın ve ardından Z yığınını belirlemek için üst ve alt Z düzlemlerini tanımlayın. Dokunun ayrıntılı üç boyutlu veya dört boyutlu Z yığınlarını elde etmek için Başlat'a basın. İnce forsepslerin uçlarını kapağın kollarındaki meme görüntüleme penceresi deliklerinden geçirin ve saat yönünün tersine bükerek kapağı gevşetin.
Alternatif olarak, doku, belirli bir ilgi alanı için görüntüleme koşullarını optimize etmek için steril künt forseps kullanılarak manipüle edilebilir veya yeniden konumlandırılabilir. Meme görüntüleme penceresinin iç kenarına petrol jölesi uygulayın ve altta yatan dokudan kaçının. Steril forseps ile pencere çerçevesini yavaşça aşağı doğru itin ve kapağı pencere çerçevesine yerleştirin.
Son olarak, ince forsepslerin uçlarını kapağın kollarının deliklerinden geçirin ve kapağı saat yönünde bükerek aydınlatın. Pubertal Rosa26 Cre / ERT2 Rosa26-membranlı domates-membran GFP farelere düşük dozda tamoksifen enjekte edildi ve bu da Rosa26-membranlı domates-membran GFP alelinin Cre-mediated rekombinasyonuna yol açtı. Fareler, gelişmekte olan meme bezindeki dinamik değişiklikleri takip etmek için bir, üç ve beşinci günlerde görüntülendi.
Temsili görüntüler, bir meme görüntüleme penceresinden görüntülenen uzun ve dallanmış bir meme kanalının birkaç gün boyunca 3D görüntüsünü göstermektedir. Dallanma ucunun ve uzamakta olan dalın tek Z-düzlemi görüntüleri burada gösterilmiştir. Stromadaki tek hücreler beyaz yıldızlarla vurgulanır.
Temsili görüntüler, bir meme görüntüleme penceresinden görüntülenen farenin kasık lenf nodunu göstermektedir. İkinci armonik nesil yeşil renkle tasvir edilmiştir. Yetişkin bir dişi E-kadherin membran CFP faresinin meme duktal yapısının art arda birkaç gün boyunca 3D render edilmiş görüntüleri burada gösterilmiştir.
Kollajen I paterni aynı ROI'yi izlemek için kullanıldı ve duktal hücreleri işaretlemek için E-kadherin membran CFP sinyali kullanıldı. Kikume yeşil-kırmızı fareleri, mor ışığa maruz kalmadan önce ve sonra sıfır gününde görüntülendi. Görüntüleme seansları, dönüşümden sonra iki, altı ve 10. günlerde tekrarlandı.
Meme bezinin aynı bölgesi 10 gün boyunca bir meme görüntüleme penceresinden görüntülendi. Daha küçük bölgeler sıfır gününde foto-dönüştürüldü ve zaman içinde Kikume kırmızı sinyalinin benzer bir seyreltme oranını gösterdi ve bu da epitel boyunca eşit bir devir hızına işaret etti. Belirtilen bölgelerin yakınlaştırma görüntüleri, foto-dönüşümden altı ve 10 gün sonra hücresel düzeyde proliferatif heterojenlik göstermektedir.
Foto-dönüşümden 10 gün sonra farklı hücrelerin kırmızı-yeşil oranının nicelleştirilmesi, aynı duktal mikro ortam içindeki bazı hücrelerin oldukça değişken seyreltme oranlarını ortaya koymuştur. Bu prosedürün önemli bir adımı, görüntüleme seansları arasında kapağı açmaktır. Pencerenin bu benzersiz özelliği görüntüleme koşullarını iyileştirir ve dokunun uzunlamasına görüntülenmesini sağlar.
Değiştirilebilir kapaklı meme görüntüleme penceresi, fare meme bezinde tümör başlangıcı ve ilerlemesi alanında in vivo, hızlı etkili ilaç testi ve taraması ile ilgili yeni soruları kolaylaştıracaktır.
