(; JC, JES ve JW CA100324; JvR için U54GM064346 JES CA77522, JC ve BG U54CA126511) Bu çalışma, ABD Savunma Bakanlığı&#39;nın (BG ve DK BC061403 BC075554), ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. D. Entenberg mikroskopi, görüntüleme kutusu ve J. Pollard (Albert Einstein Tıp Koleji) F4/80 antikor üretiminde yardım M. Rottenkolber ile yardım için teşekkür ederim.

1. Floresan tümörlerin meme yağ yastığı içine tümör hücrelerinin enjeksiyonu kullanarak Üretimi: <ol><li> % 80 confluency - 40 Dendra2 protein (sitoplazmik bir belirteci olarak) ifade eden bir hücre hattı büyütün. </li><li> PBS w / o Ca 2 yemekleri en az 3 kez durulayın + veya Mg 2 +. </li><li> 37 10 cm çanak ve inkübe başına 3 ml tripsin ekle ° C hücrelerinin çoğu ayırmak ve daha sonra düz bir yüzeye karşı çanak vurmak sallamak kadar. </li><li> Çanak kapalı tüm hücreleri durulayın ve matris de toplamak için bir kazıyıcı (kauçuk polis) kullanın. 5 ml PBS ekleyin. Santrifüj sırasında saymak için bir kısım. </li><li> 5 dakika boyunca 800 g santrifüjleyin. </li><li> Aspire ve 5 &#39;lik bir konsantrasyon için PBS içinde tekrar süspansiyon - 10x 10 6 / ml. Enjekte kadar (30 dakika içinde enjekte) buz üzerinde saklayın. </li><li> 4-5 haftalık kadın bağışıklık eksikliği olan farelerde (örneğin SCID) içeren steril bir kaput içinde bir kafes yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ile 4. (karın) meme başı etrafındaki alanı püskürtün. </li><li> Meme yağ yastığı içine 0.1 ml enjekte edilir. Eğer bir asistan, bir kişi bir yerde fare tutabilir, diğer meme yağ yastığı içine iğne ekler. Kendinize enjekte ederek, izofluran kullanarak hafif anestezi altında fare koymak. </li><li> Tümör 5-7 mm büyüdü sonra, Meme Görüntüleme Pencere (MIW) takılmalıdır. Not: Alternatif olarak, bazı uygulamalar için MIW, sağlıklı meme yağ yastığı üstüne yerleştirilir ve daha sonra hücreler enjekte edilebilir. Bu yaklaşım, fizyolojik bir ortamda geçici transfekte hücreler görüntüleme sağlar. </li></ol> 2. Meme Görüntüleme Pencere (MIW) Manuel imalat: <ol><li> MIWs (Şekil 1A) biyouyumluluk garanti doku sınıf plastikten yapılır. Manuel inşaat için, 5 veya 10 cm çanak kullanmanızın. </li><li> Lateks eldiven koyun. </li><li> Bir doku kültürü çanak Isı ve ısıtmalı çanak (Bunun için 1-inç dremmel bit kullanımı) karşı bir yuvarlak, sert bir cisim basarak kavisli bir yüzeye ibaret. </li><li> Merkezi ısıtmalı bir jilet kullanarak çanak kesin. </li><li> Kubbe şeklinde plastik taban (çapı 6-7mm) merkezinde bir delik yapmak için küçük, şeklinde koni dremmel biraz kullanın. </li><li> Dremmel ile kumlama ve daha da dosyalama plastik taban kenarları tamamen düz olun. </li><li> Dosya cam lamel için düz bir yüzeye plastik taban üst. Başvurarak, düz bir yüzey çapı 9-10mm olmalıdır. </li><li> Tutkal superglue kullanarak basık yüzey üzerine 8mm yuvarlak cam lamel (1 numara) (siyanoakrilat yapıştırıcı). </li><li> Kuru tutkal (15 dakika) bekleyin. </li><li> Tabanının içine dışarıdan (cam) delinmesiyle sekiz sütür delik açmak için ısıtmalı bir 26g iğne kullanın. Delikler, lamel kenarından 0,5-1mm uzaklıkta, eşit lamel etrafında dağıtılmış olmalıdır. </li><li> 5-0 sütür iğnesi kullanarak delikler genişletin. </li><li> Plastik tabanı delik delme, iç yüzeyi pürüzlü hale getirecektir. Zımpara kağıdı kullanarak, yüzeyi tamamen düz olun. </li><li> Küçük bir fırça kullanarak MIW küçük plastik parçacıkların eldiven ve fırça değiştirin. </li><li> MIW deiyonize su ile yıkayın. </li><li> % 70 etanol kullanarak MIW yıkayın. Q-ucu tamamen şeffaf cam temizlemek için kullanın. Tutkal buhar sisli lekeler varsa, bir Q-tip ile aseton dikkatli kullanın. </li><li> Yanlardan en az 3 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalma MIW sterilize edin. </li></ol> Meme Görüntüleme Pencere (MIW) Yarı Manuel fabrikasyon Plastik taban imal etmek için, şu anda silikon kauçuk döküm kalıpları kullanarak el yapımı MIWs kullanarak oluşturdu. Kalıp silikon kauçuk, sonra hemen araya polyester reçine ile doldurulur ve tekrar orijinal ön ve her ikisi de tam bir kopyasını yapmak üzere iki kısımdan oluşur. Sıvı polyester reçine birlikte 09:10 karıştırılır ve sert bir yapı içinde 48 saat içinde tam olarak tedavi sonuçları. Plastik parçalayarak ya da zaman içinde sarı olma UV korumalı ve arşiv. Sonra, temel tedavi adımları 2,8-2,16 el yapımı MIWs için aynı şekilde yapılır. 3. MIW yerleştirilmesi: <ol><li> 4. meme etrafında küçük bir (5-7 mm çapında), tümör hücre tipi (Şekil 1B) bağlı olarak tümör hücrelerinin enjeksiyonu sonrasında birkaç gün / hafta Dendra2 photoswitchable protein veya diğer floresan proteinleri ifade hücre enjeksiyonu kullanılan hücre hattı bağlıdır sonra ne kadar zaman geçti. Gözle görülür nekrotik tümör ve tümörün üstüne saç ile sağlam bir cilde sahip olmalıdır. Nekrotik tümörleri olan farelerin ötenazi olmalı. </li><li> Için steril alanda steril bez hazırlayın steril bir kaput içinde bir parça aşağı cerrahi yatıyordu. G steril bir parçası koyunortasında auze ve onun etrafında bir kaç MIWs ve steril aletler yatıyordu: küçük standart makas, yaylı makas, microdissecting cımbız, microdissecting forseps, iğne tutucu kullanın. Q-ipuçları% 70 etanol ve kaput köşesinde steril eldiven, bir şişe steril tutun. </li><li> Fare HBSS% 2.5 AVERTIN IP enjeksiyon (20 ul / g) kullanarak steril kaput anestezi veya alternatif olarak 10 mikrogram / kg ketamin + 10 mg / g ksilizin (onayları ve sipariş için Hayvan Bakım Enstitüsü ile temas). Not: Avertin çözüm hazırlanmalıdır iki haftada bir, filtre 0.22 mikron filtre ve 4 500 ul alikotları olarak saklanır kullanarak sterilize ° C (koyu). </li><li> Saç, küçük bir hayvan tıraş makinesi kullanarak tümör üzerindeki alana tıraş tarafından çıkarın. </li><li> Nair epilasyon kremi (herhangi bir eczane mevcuttur) kullanarak saç geri kalanı çıkarın. Etanol-daldırma Q-ipuçları kullanarak cilt temizleyin. </li><li> Hayvan steril gazlı bez üzerine aktarın ve kurutma ve enfeksiyon onları tutmak için gözlerine oftalmik merhem uygulayın. </li><li> Betadin ile cilt sterilize ve% 70 etanol ile temizleyin. </li><li> Steril kaput içinde steril cerrahi bir beze hayvan aktarın. </li><li> Cilt, cilt ve kesme ~ 2mm kesi forseps kullanarak meme hemen medial çekin. </li><li> Diseksiyon makas ve forseps kullanarak deri altında yatan meme yağ yastığı ayırın. MIW ekleme ağırlayacak bir boyutu bu ayrılık adım sırasında cilt ve delik streç. </li><li> Yanlışlıkla bir gemi sugery sırasında isabet ederse, üretilen / aşırı haline gelen kanamayı durdurmak için herhangi bir kan kaldırmak için steril bir Q-ipuçlarını kullanın. </li><li> MIW yerinde MIW taban ve sütür üst deri emilmeyen parçacığı kullanarak ve iğne kesme ters olduğu gibi yerleştirin. </li><li> Sütür delikleri doldurmak ve cilde MIW güvenli bir doku yapıştırıcısı veya siyanoakrilat kullanın. </li><li> TMP-SMX antibiyotik karışımı ekleyin: (Sulfamethoxazole 0.6 mg / ml, Trimetoprim 0.12 mg / ml), ameliyat öncesi ve sonrası 3 gün boyunca kafes su şişesi. </li><li> Hayvan AVERTIN IP enjeksiyondan sonra 1-4h anestezi altında kalır. Ameliyat genellikle ~ 45dakika sürer, hayvan daha sonra kurtarmaya yardımcı olması için önemlidir: </li><li> Bir yandan ısıtma yastığı kafesinin altındaki (37 ° C) (eczane mevcut) yerleştirin ve gazlı bez ile örtün. </li><li> Onun mide döner ve yürümeye başlayana kadar yastık üstünde hayvan tutun. </li><li> Hayvan 3h daha fazla bilinçsiz ise, rehidrasyon için 0.3 ml HBSS intraperitoneal enjekte edilir. </li><li> Hayvan sonraki 3-4 gün içinde ilk görüntüleme oturumu gerçekleşmeden önce kurtarmak için izin verilir. </li></ol> 4. Görüntüleme Kutusu İnşaatı Görüntüleme kutusu MIW mikroskop amacı sağ üstünde, düz oturma olduğunu garanti eder. Ayrıca izofluran sürekli hava akımı sayesinde sıcaklık ve anestezi kontrolünü kolaylaştırır. Kutusu pleksiglas ve plastik kaynak kullanarak birbirine yapıştırılmış. Bu özel mikroskop aşaması için donatılmıştır ve bu yüzden kendi alt şekil (Şekil 2 Leica SP5 mikroskop sahne monte kutu düzenini gösterir) kullanılan mikroskop bağlı olarak değişir. Santimetre olarak kutu boyutları l = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Şekil 2A). Leica SP5 mikroskop sahne içinde uygun çukur bir tabak, 12.7x8.4 cm boyutunda, ve iki sürgülü &quot;kapılar&quot;, dairesel bir açılış (formu 5.7 X 5.7 cm_each, kutunun altındaki oluşur d = 2.22 cm kapatıldığında.) Bu açılış MIW sığar. Ön parça yan parçaları bir vakum yol açan bir çıkış deliği içerir anestezi teslimat için giriş deliği içerir. Kondansatör ve slayt tutucu görüntüleme kutusu yerleştirme önce kaldırılması gerektiğini unutmayın. 5. Görüntüleme Kutusu kullanın. <ol><li> Izofluran ile anestezi altında hayvan koyun ve gözleri oftalmik merhem uygulayın. </li><li> Giriş deliği (Şekil 2B) dışında, anestezi makine görüntüleme kutusu ön izofluran egzoz takın. </li><li> Görüntüleme kutusunun çıkış deliği ikinci bir tüp takın. Bu tüp gaz filtre ve ardından vakum eklenmelidir. </li><li> Kutusunun kapağını açın ve kutusu kapıları açmak ve hayvan, MIW yan bakan alt yerleştirin ve kutuya sürgülü kapılar. </li><li> Kutusunu tutun ve MIW üssüne düzenlenen ve aralarında hareketsiz böylece alt kapı ayarlayabilirsiniz. MIW lamel bu seviyenin altında sadece birkaç milimetre olmalıdır MIW tabanı, görüntüleme kutusu kapıları olarak aynı düzeyde olmalıdır. Alt kapı kutusu paralel sürgülü kapılar alt kenarı arasındaki MIW konumlandırma lamel (MIW cam kısım) düz yatıyor olmasını sağlar emin olun. Bu doğru odaklama sağlayacaktır. </li><li> Kutusunun yerleştirilmesi için uzay izin vermek için, mikroskop hedefi Altmikroskop aşamasının. </li><li> Mikroskop sahnede kutu yerleştirin ve MIW lamel amacı yukarıda böylece sahne ayarlamak. </li><li> Odak amaç ve görüntüleme başlatmak. </li><li> Izofluran kullanırken, hayvan solunum frekansı görsel muayene ile takip edilmelidir. Bu, görsel veya görüntüleme toplama (bu veri toplama ile müdahale) sırasında görünen solunum eserler frekans izleme yapılabilir. MouseOx pulse oksimetre sistemi (Starr yaşam Bilimler Corp) başarıyla kullanılmaktadır. Bu şekilde hayvan kontrol odasında ışıkları dönüm olmadan sürekli veri elde edilebilir. Not: Her görüntüleme seanstan sonra, hayvan kurtarma, küçük bir gazlı bez ya da Kimwipes el ısıtma yastığı sarma ve hayvan kafesine altına koyarak kolaylaştırılması gerekmektedir. Not: bir daldırma amacı MIW ile görüntü için kullanılır ise, daldırma orta (gliserol, su, yağ) görüntüleme penceresi temizlenir olmalıdır. MIW görüntüleme sırasında meydana gelmiş olabilecek herhangi bir çatlak ya da diğer hasarlar açısından kontrol edilmelidir. Bu çoklu görüntüleme oturumları sırasında veri toplamak için kritik öneme sahiptir. </li></ol> 6. Dendra2 etiketli hücrelerinin Photoswitching ve görüntüleme Leica SP5 konfokal mikroskop için prosedürü tarif; optimize etmek için bir rehber olarak kullanılması gereken diğer konfokal mikroskoplar kullanarak veya multiphoton görüntüleme kurarken odak düzlemli lazer gücü, hedefleri ve yazılım seçenekleri değişir ve bu nedenle aşağıda açıklanan protokol mikroskopta deneme. <ol><li> Yeşil floresan filtre ile gözmerceği (10x) ile tümör gözlemleyerek, büyük kan damarları gözle görülür bir şekilde akan ve aynı odak düzlemli düz döşeme bulun. </li><li> PMT tespiti için alan ve anahtar merkezi damarlarının bir konum. </li><li> Iki kanal için sıralı görüntüleme toplama ayarlayın. Kanallardan biri 488nm lazer çizgisi (% 10 güç) kullanır ve Dendra2 (505-540nm) yeşil formu ekstrasellüler matriks (480-495nm) ve emisyon saçılma toplar. Ikinci kanal 543nm lazer çizgisi (% 90 güç) kullanır ve Dendra2 kırmızı formu (555-600Nm) emisyon toplar. 3D görüntü ön photoswitching toplayın. </li><li> 405nm lazer çizgisi (% 30 güç, 20-40 taramaları) kullanarak hücrelerin seçilmiş bir nüfus photoswitch ROI tarama seçeneği kullanın. Anahtarlama izlemek için protein kırmızı formu emisyon toplayın. </li><li> 6.3 &#39;de aynı sıralı rutin kullanarak 3 boyutlu görüntüleri, post-anahtarlama toplamak. </li><li> Eğer tümör birden fazla bölge photoswitching, hem yeşil ve kırmızı kanalları (Şekil 3A, B), bir dijital kamerayı kullanarak Okülerin üzerinden fotoğraf çekmek için tavsiye edilir. Bu yönde, daha sonraki görüntüleme oturumları sırasında yardımcı olacaktır. Not: Ayrıca, kan damarlarının geçici olarak floresan dekstran (Cascade Mavi veya Alexa Fluor 647, hem de 10kDa) kuyruk ven enjeksiyon kullanarak etiketli olabilir. Dextrans enjeksiyon Birkaç saat sonra kan damarları terk ve kalıcı makrofajlar etiket. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 3C kan damarı (hiç floresan) göre dikey olarak odaklı bir dikdörtgen photoswitched bölgesi (kırmızı) gösterir. Sigara photoswitched hücrelerin ekstrasellüler matriks saçılma mor, yeşil. Resim dört görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyon Z-ekseni boyunca (20-50 mikron derinliğinde).

<ol>
	<li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein.">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li><li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein,+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy,+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis.">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li><li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+gene+expression,+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li><li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling.">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li><li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+microenvironment+of+mammary+tumors+using+multiphoton+microscopy.">Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2.">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS w/o Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM media (MDA-MB-231 cells)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11965</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane(Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td># NDC 10019-773-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SCID mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NCI</td>
<td>N/A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353003</td>
<td>Custom Order</td>
</tr>
<tr>
<td>Circular coverslip 8 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific, Inc.</td>
<td>8CIR-1-FIS</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dendra2 photoswitching through the mammary imaging window

Tek hücreli çözünürlükte fare ve sıçanlarda son on yıl içinde, meme tümörlerinin intravital mikroskopi<sup&gt; 1-4</sup&gt; Mekanizmaları, göç, istila ve tümör hücrelerinin intravasation gibi metastatik davranışı önemli bilgiler sonuçlandı<sup&gt; 5, 6</sup&gt; Anjiyogenez<sup&gt; 3</sup&gt; Ve bağışıklık hücrelerinin tepki<sup&gt; 7-9</sup&gt;. Biz son zamanlarda birden çok intravital görüntüleme oturumda yaşayan farelerde görüntü ortotopik meme karsinomları için bir teknik bildirdin<sup&gt; 10</sup&gt;. Bunun için, biz Dendra2 Meme Görüntüleme Pencere (MIW) ve optimize edilmiş görüntüleme parametreleri geliştirdik<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching ve görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt;. Burada, biz, özel bir görüntüleme kutusunu kullanarak Dendra2 etiketli tümör hücrelerinin bir tümör görüntüleme ve üstüne MIW ekleme MIW üretim için protokol tanımlar. Bu protokol görüntü metastatik tümörlerde belirgin mikroçevrelerde tümör hücrelerinin davranış için kullanılır ve kan damarları, tümör hücreleri ve ana hücreleri uzun süreli görüntüleme sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window at JoVE.com

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Meme Görüntüleme Penceresi ile Dendra2 etiketli tümör hücrelerinin intravital photoswitching ve izleme, bize görüntü gün bir zaman ölçeği üzerinde seçilen tümör mikroçevrelerde tümör hücrelerinin metastatik davranış sağlayan bir tekniktir.

Meme Görüntüleme Penceresi yoluyla Dendra2 Photoswitching

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Görüntüleme.  Albert Einstein College of Medicine - Yeshiva University. Meme Görüntüleme Penceresi ile Dendra2 etiketli tümör hücrelerinin intravital photoswitching ve izleme, bize görüntü gün bir zaman ölçeği üzerinde seçilen tümör mikroçevrelerde tümör hücrelerinin metastatik davranış sağlayan bir tekniktir.

Video: Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is a powerful technique. Using in vivo 2-photon microscopy through a cranial window it is possible to image fluorescent dyes injected intravenously. This permits one to image the cortical vasculature and also to obtain measurements of blood flow. This technique was originally developed by David Kleinfeld and Winfried Denk. The method can be used to study blood flow dynamics during or after cerebral ischemia, in neurodegenerative disorders, in brain tumors, or in normal brain physiology. For example, it has been used to study how stroke causes shifts in blood flow direction and changes in red blood cell velocity or flux in and around the infarct. Here we demonstrate how to use 2-photon microscopy to image blood flow dynamics in the neocortex of living mice using fluorescent dyes injected into the tail vein.

Cortical blood flow dynamics can be studied in vivo by imaging fluorescent dextran dyes injected into the tail vein of rodents with 2-photon microscopy. This video shows how to image blood flow dynamics in neocortex of mice through a glass-covered cranial window preparation.

Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

Biyoloji

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Fare Meme Epitel Hücreleri lactogenic Farklılaşma sırasında Mammospheres formu

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Meme Epitel Nakli Prosedürü

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Fare meme bezi Lokalize İlaç Teslim Intradüktal Enjeksiyon

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.

Sığır meme bezi biyopsisi teknikleri

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, ...

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is key to understanding not only its life cycle, but also to uncover imbalances in the proteostasis network. This method shows how to track the degradation of the disease-causing protein huntingtin. Two versions of huntingtin fused to Dendra2 are expressed in the C. elegans nervous system: a physiological version or one with an expanded and pathogenic stretch of glutamines. Dendra2 is a photoconvertible fluorescent protein; upon a short ultraviolet (UV) irradiation pulse, Dendra2 switches its excitation/emission spectra from green to red. Similar to a pulse-chase experiment, the turnover of the converted red-Dendra2 can be monitored and quantified, regardless of the interference from newly synthesized green-Dendra2. Using confocal-based microscopy and due to the optical transparency of C. elegans, it is possible to monitor and quantify the degradation of huntingtin-Dendra2 in a living, aging organism. Neuronal huntingtin-Dendra2 is partially degraded soon after conversion and cleared further over time. The systems controlling degradation are deficient in the presence of mutant huntingtin and are further impaired with aging. Neuronal subtypes within the same nervous system exhibit different turnover capacities for huntingtin-Dendra2. Overall, monitoring any protein of interest fused to Dendra2 can provide important information not only on its degradation and the players of the proteostasis network involved, but also on its location, trafficking, and transport.

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

Presented here is a protocol to monitor degradation of the protein huntingtin fused to the photoconvertible fluorophore Dendra2.

Fotodönüştürülebilir Dendra2 kullanarak Yaşlanma C. Elegans Protein Ciro Vivo Quantification

Proteins are synthesized and degraded constantly within a cell to maintain homeostasis. Being able to monitor the degradation of a protein of interest is ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory mechanisms. During pregnancy, the gland expands from a primitive ductal tree embedded in a fat pad to a highly branched alveolar network primed for the formation and secretion of colostrum and milk. Post-partum, the gland supplies all the nutrients required for neonatal survival, including membrane-coated lipid droplets (LDs), proteins, carbohydrates, ions, and water. Various milk components, including lactose, casein micelles, and skim-milk proteins, are synthesized within the alveolar cells and secreted from vesicles by exocytosis at the apical surface. LDs are transported from sites of synthesis in the rough endoplasmic reticulum to the cell apex, coated with cellular membranes, and secreted by a unique apocrine mechanism. Other preformed constituents, including antibodies and hormones, are transported from the serosal side of the epithelium into milk by transcytosis. These processes are amenable to intravital microscopy because the mammary gland is a skin gland and, therefore, directly accessible to experimental manipulation. In this paper, a facile procedure is described to investigate the kinetics of LD secretion in situ, in real-time, in live anesthetized mice. Boron-dipyrromethene (BODIPY)665/676&#160;or monodansylpentane are used to label the neutral lipid fraction of transgenic mice, which either express soluble EGFP (enhanced green fluorescent protein) in the cytoplasm, or a membrane-targeted peptide fused to either EGFP or tdTomato. The membrane-tagged fusion proteins serve as markers of cell surfaces, and the lipid dyes resolve LDs &#8805; 0.7 &#181;m. Time-lapse images can be recorded by standard laser scanning confocal microscopy down to a depth of 15-25 &#181;m or by multiphoton microscopy for imaging deeper in the tissue. The mammary gland may be bathed with pharmacological agents or fluorescent dyes throughout the surgery, providing a platform for acute experimental manipulations as required.

<meta charset="utf8"></head><body>Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

The present protocol describes a facile technique for the intravital imaging of the lactating mouse mammary gland by laser scanning confocal and multiphoton microscopy.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...