Bu protokol, kanserle ilişkili fibroblastları veya CAF'yi aktive etmede tümör mikro ortamının önemini vurgulamaktadır. Fenotipik özellikleri incelemek için in vitro model mükemmel olabilir. CAF biyolojisindeki en büyük kısıtlamalar, primer tümör biyopsi örneklerinden CAF'nin sınırlı mevcudiyetidir.
Dolayısıyla bu teknik, CAF biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmada anormal çapraz üretim ve CAF aktivasyonu ile ilişkili mitokondriyal disfonksiyon kötü tümör prognozuna yol açmıştır. Bu yöntemin uygulanması, tümörün travma etkileşimlerini, özellikle CAF aktivasyonunu ve mitokondriyal sağlığı değerlendirmek için yararlı olacaktır.
Yeni uyuşturucu hedeflerini keşfetmek için. Bireyler bu tekniği uygulamadan önce hücre prosedüründe deneyim sahibi olmalıdır. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi, CAF popülasyonunu tümör sferoidlerinden izole etmedeki kritik adımların ve CAF biyolojisini incelemek için aşağı akış uygulamalarının anlaşılmasını sağlayacaktır.
Laboratuvarımın asistanları Bayan Leena Arora, Bayan Moyna Kalia ve Bayan Soumyajit Roy deneyleri gerçekleştiriyor. DMEM'deki insan akciğer adenokarsinomu A549 ve insan akciğer fibroblastı MRC-5 yapışkan hücreleri ve RPMI'daki insan monositleri THP-1 hücreleri, T25 şişelerinde% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede büyüme ortamını tamamlamaya başlamak için.
Üç gün sonra,% 80 ila% 85 hücre akıtlığında, A549 ve MRC-5 hücrelerini bir dakika boyunca bir mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca 500 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ile inkübe ederek hasat edin. Ardından, tripsini inaktive etmek için hemen dört mililitre tam büyüme ortamı ekleyin.
Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve beş dakika boyunca 125 x g'de toplayın. Süpernatantı çıkarın ve hücreleri beş mililitrelik tam bir büyüme ortamında yeniden askıya alın. Çok hücreli tümör sferoidlerini oluşturmak için, bir mililitre hacim için bir hücre sayacı kullanarak A549, MRC-5 ve THP-1 hücre numaralarını sayın.
Saydıktan sonra, hücre süspansiyonunu 5: 4: 1 oranında hazırlayın ve tam DMEM ile hacmi bir mililitreye kadar yapın. Daha sonra, 90 milimetrelik bir kültür kabının kapağına 25 mikrolitre hücre süspansiyon karışımı damlası yerleştirin. Tabağın dibini 10 mililitre steril suyla doldurun.
Kapağı suyla dolu hidrasyon odasının üzerine dikkatlice ters çevirin ve çanağı üç gün boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Dördüncü günde, sferoidleri mikroskop altında izleyin. Görüntü almak için güç düğmesini açın.
90 milimetrelik kültür kabını sahneye yerleştirin ve 10 x büyütmeyi seçin. Lensleri ayarlayın ve hücre toplanmasını ve çoğalmasını analiz etmek için hücreleri inceleyin. Görüntüyü yakalamak için sağlanan dondurma ve kaydetme düğmelerine basın.
Görüntülemeden sonra, her damlacıktan 20 mikrolitre ortamı taze bir ortamla dikkatlice aspire ederek büyüme ortamını değiştirin. Live-dead görüntüleme için, birinci anahtar olan Ctr advanced'i, ardından CPU'yu açın ve yazılım sisteminin önyüklenmesini bekleyin. Önyüklendiğinde, sferoidler içeren 90 milimetrelik çanağı ters floresan mikroskobun sahnesine yerleştirin.
Ardından, yazılımdaki floresan seçeneğini seçerek ve calcein ve Texas Red kanalı için FITC'yi seçerek görüntüleri 10 x büyütmede gözlemleyin ve yakalayın. Ardından, görüntüyü canlı olarak yayınlayın ve görüntüleyin seçeneğini belirleyin. Uygun optimizasyon için floresan yoğunluğunu ayarlayın ve güvenli düğmeye tıklayın.
Bir mililitrelik pipet ve 15 mililitrelik bir tüp kullanarak her biri yedi ve 10. günde 200 tümör, sferoid toplayın. Daha sonra sferoidleri beş dakika boyunca 125 x g'de santrifüjleme ile pelet edin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Sferoidleri 200 mikrolitre PBS ile yıkayın, tekrar santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
Küresel parçalanma için 400 mikrolitre% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Sferoidlerin tamamen parçalanması için kuvvetli pipetleme yapın. Bir mililitre tam DMEM büyüme ortamı ekleyerek tripsini nötralize edin.
Daha sonra küresel süspansiyonu santrifüj edin ve peleti bir mililitre tam DMEM ortamında yeniden askıya almadan önce süpernatantı atın. Gösterildiği gibi toplam hücre sayısını sayın. Kanserle İlişkili Fibroblastların veya CAF'ların tümör sferoidlerinden izolasyonu için, 80 mikrolitre soğuk manyetik aktif hücre sıralama veya MACS tamponunda yedinci hücrelere 1 x 10 oranında yeniden askıya alın.
Hücre süspansiyonuna 20 mikrolitre anti-fibroblast mikroboncuk ekleyin, tüpe hafifçe dokunarak ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe ederek iyice karıştırın. Kuluçkadan sonra, hücreleri bir mililitre soğuk MACS tamponu ile yıkayın. Daha sonra, peleti 500 mikrolitre MACS tamponunda yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve aspire edin.
Manyetik boncuk bazlı hücre ayrımı için, MACS sütununu üç mililitre MACS tamponu ile durulayarak hazırlayın. Hücre süspansiyonunu sütuna yerleştirin ve etiketsiz hücre popülasyonunu içeren akışı toplayın. Ardından, separatörden çıkarmadan önce sütunu üç mililitre MACS tamponu ile üç kez yıkayın.
Ardından sütunu toplama tüpüne yerleştirin. Anti-fibroblast mikroboncuk etiketli hücreleri, beş mililitre MACS tamponu ekleyerek ve pistonu kolona sıkıca iterek toplayın. Aşağı akış uygulamalarına geçmeden önce etiketli hücreleri santrifüj yapın.
İzole edilmiş CAF'ların sayısını sayın ve akış sitometrisi analizi için dördüncü hücrelere yaklaşık 6 x 10 kullanın. Hücreleri PBS ile bir kez yıkayın, ardından süpernatanı santrifüj yapın ve aspire edin. Daha sonra, 100 mikrolitre hücre geçirgenlik tamponu ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonunu korumak için aralıklı vorteksleme ile hücreleri 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Yine, santrifüjleme ve hücreleri geçirgenlik tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, iki mikrolitre APC konjuge anti-insan alfa SMA antikoru ekleyin ve 45 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, fazla antikoru gidermek için bir mililitre geçirgenlik tamponu ve santrifüj ekleyin. Akış sitometrisi için peleti 400 mikrolitre geçirgenlik tamponunda yeniden askıya alın.
ACTA2 pozitif hücreleri, hücre popülasyonlarını ileri ve yan saçılmalarına göre ayırt ettikten sonra seçin. Tekli popülasyonun seçilmesi ve ardından tek parametreli histogramda tek bir tepe noktası olarak görünen ACTA2 pozitif hücrelerinin seçilmesi. Çok hücreli tümör sferoidlerinin gelişimi ve canlı-ölü analizi burada gösterilmiştir.
Yedinci günde, sferoidler yaklaşık 260 mikron çapında kompakt ve sertti. 10. günde, sferoidlerin çapı 480 mikrondu. Hücre canlılığı testinde, propidium iyodür floresansında bir azalma ve yedinci günden 10. güne kadar kalsein-floresansında bir artış gözlenmiştir.
Hipoksik boyama, günün merkezinde 10 sferoid hipoksik bir çekirdek ortaya çıkardı. Ayrıca, E-kadherin ve Mki-67 gen ekspresyonunun yukarı regülasyonu, tümör sferoid oluşum günlerindeki artışla birlikte gözlenmiştir. 10. gün tümör sferoidlerinden izole edilen CAF'lar yaklaşık% 69 ACTA2 pozitifti.
CAF'lar, MRC-5 fibroblastlarına kıyasla ACTA2'de üç kat ve kollajen tip 1 alfa 2 zincirinde on kat yukarı regülasyon gösterdi. 10. gün tümör sferoidlerinde ROS düzeylerinde yedinci güne kıyasla anlamlı bir artış gözlendi ve bu da ROS üretiminin CAF aktivasyonuna olası katılımını düşündürdü. Yedinci gün ve 10. gün tümör sferoidlerinden izole edilen CAF'larda hücresel ROS seviyelerinde anlamlı bir artış gözlenmiştir.
Ayrıca, JC-1 boyaması ile mitokondriyal membran potansiyelinde bir değişiklik görülmüştür. Normal fibroblastlara kıyasla CAF'larda GLUT1 ve MCT4 gen ekspresyonunun indüksiyonu gözlendi. CAF'larda laktat dehidrojenaz, Sitokrom C oksidaz ve süksinat dehidrogenaz enzim aktivitesinin normal fibroblastlara göre anlamlı indüksiyonu gözlendi.
3D çok hücreli tümör sferoidinin başarılı gelişimi için A549, MRC-5 ve THP-1 hücrelerinin 5: 4: 1 oranı kullanılmalıdır. Fibroblast popülasyonu, tümör sferoidlerinin sertliği için kritik öneme sahiptir. Katyon çözeltisi ve karakterizasyonuna benzer şekilde, bu tümör sferoidi, tümör progresyonunda bir suç ortağı olan tümörle ilişkili makrofaj hücresi popülasyonunu elde etmek için de kullanılabilir.
Bu sferoid analiz, kanserli hücrelerin fibroblastı nasıl geçtiğini anlamamıza yardımcı olacaktır ve ayrıca mitokondriyal spesifik ilaç adaylarını kontrol etmek için de kullanılabilir.
